高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇的不确定度评定

孙栋，王爱英，刘红彩，刘沛生，陈爱景

(山东省淡水渔业研究院，济南 250117)

喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，是抗菌促进生长剂，具有促进蛋白同化作用，可提高饲料转化率、加快动物生长，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有一定的抑制作用，同时对四环素、氯霉素等耐药菌株仍然有效，常用于治疗养殖鱼类出血性败血症、疗疮病等[1-3]。研究表明喹乙醇具有遗传毒性、生殖毒性、致畸突变毒性[4-6]，对人也有潜在的三致性(即致畸形、致突变、致癌)[7]。美国、欧盟禁止喹乙醇用作饲料添加剂。中国兽药典2005 版规定喹乙醇禁用于35 kg 以上的猪和禽、鱼等其它种类动物。为保障动物产品质量安全，喹乙醇被列为开展风险评估和安全评价的重要兽药残留之一。

为评估测量方法的可靠性和测量结果的可信程度，需要对测量的不确定度进行评定。通过分析不确定度的来源、分量大小，明确测定过程中各因素对测量结果不确定度的影响程度，进而提高测量结果的准确性[8-11]。对水产品中的喹乙醇进行测定，当检测结果接近限量值时，对测定过程中的不确定度评定是判定样品合格与否的重要依据。

笔者采用SC/T 3019—2004 《水产品中喹乙醇残留量的测定 液相色谱法》[12]对水产品中的喹乙醇进行测定，依据JJF 1059.1—2012 《测量不确定度评定与表示》，对测量结果的不确定度进行评定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 型，配紫外-可见检测器，C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：(1) XP205 型，感量为0.01 mg/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司；(2)BSA2202S 型，感量为0.01 g，德国赛多利斯股份公司。

喹乙醇标准物质：纯度为97.89%（质量分数），扩展不确定度为0.73%，批号为G 141461，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

甲醇、正己烷：色谱纯，德国默克股份两合公司。

助滤剂：硅藻土，分析纯，500 g/瓶，天津市大茂化学试剂厂。

实验所用其它试剂均为分析纯。

水产品样品：鲤鱼，养殖产地抽检样品，抽样现场去鱼鳞，取背脊肌肉绞成鱼糜，冷冻保存。

实验用水为纯净水。

1.2 实验方法

SC/T 3019—2004 《水产品中喹乙醇残留量的测定 液相色谱法》。

1.2.1 标准溶液的制备

准确称取喹乙醇标准品10.22 mg，用甲醇稀释至100 mL，配成质量浓度为100 mg/L 的标准储备液；取此储备液10 mL，再用甲醇稀释至100 mL；配成质量浓度为10 mg/L 的标准使用液；分别取喹乙醇标准使用液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，再用15%甲醇水溶液分别稀释至100 mL，配成质量浓度浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的系列标准工作溶液。

1.2.2 样品溶液的制备

称取鲤鱼鱼糜样品10.00 g 于100 mL 均质杯中，加入助滤剂1 g、乙腈30 mL，均质1 min，以4 000 r/min 转速离心10 min，将上清液倒入锥形瓶中，再加入20 mL 乙腈，重复提取一次，合并上清液；向提取液中加入正己烷10 mL，振荡分层，弃去正己烷相，重复一次，将乙腈层转移到旋蒸瓶中，于45 ℃水浴旋蒸除去溶剂，用1.0 mL 15%的甲醇溶液溶解残留物，过0.45 μm 滤膜，置于2 mL 样品瓶中，用液相色谱法检测。

2 数学模型

3 不确定度来源分析与评定

参照文献[13]对本测量过程的不确定度进行评定。

3.1 不确定度来源分析

从数学模型和检测过程分析，高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量的不确定度来源，主要包括：(1)样品称量质量的不确定度，主要由天平的允差、重复性、分辨力和偏载误差引入的不确定度组成；(2)样品溶液体积引入的不确定度，主要由容量瓶容量允差、重复性和温度变动导致的不确定度组成；(3)样品溶液浓度校准过程引入的不确定度，包括标准溶液配制浓度的不确定度，以及用最小二乘法拟合标准曲线校准计算出定容溶液中喹乙醇浓度所引入的不确定度；前者由标准物质纯度，称量和配制、稀释操作的不确定度组成；后者包含高效液相色谱法重复测定的不确定度；(4)测量重复性引入的不确定度，由检测过程中的提取、净化、浓缩、定容、操作人员的熟练程度以及仪器本身性能等因素的影响而产生的。前3 项中由重复性引入的不确定度均已包含在总的测量重复性引入的不确定度中，在评定各项不确定度时，不再分析重复性分量引入不确定度的贡献大小。

3.2 测量不确定度分量的评定

3.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(ms)

样品质量ms不可能直接测量给出，是通过2 次称量给出的，样品容器质量m0，按去皮键示值为零，样品和容器质量为m1，数学模型：ms=m1-m0；m1和m0是用同一台电子天平测量的，是相关量；但是ms是m1和m0的差值，其系统偏差被抵消，是负相关(相关系数接近-1)，因此，采用互不相关的合成规则(方和根)进行合成[14]，质量m1与质量m0的标准不确定度评定方法相同，二者不确定度评定结果相同。

感量为0.01 g 的电子天平最大允许误差为±0.05 g，区间半宽度a=0.05 g，m测量值落在该区间的概率分布为矩形分布，包含因子k= 3，电子天平最大允许误差引入的标准不确定度：

3.2.2 样品溶液体积引入的相对标准不确定度urel(Vs)

制造商提供的1 000 μL 移液器容量允许误差为±0.8%，按三角分布处理，包含因子k2= 6，容量允差引入的标准不确定度：

以上不确定度分量互不相关，则样品溶液体积引入的合成标准不确定度：

3.2.3 样品溶液质量浓度引入的相对不确定度urel(ρs)

(1)标准溶液配制引入的标准不确定度u1(ρm)。

标准储备液配制引入的标准不确定度u(ρ0)。由标准储备液配制数学模型式(2)可得出：标准储备液浓度的标准不确定度主要由标准物质的纯度P、质量m0和定容体积V0引入的。喹乙醇的标准物质证书纯度为97.89%，不确定度为±0.73%，包含因子k=2。称量标准物质所用天平最大允许误差为±0.05 mg，分辨力为0.01 mg，偏载误差为-0.1 mg。使用100 mL 的容量瓶进行定容，环境温度(20±5)℃，相对湿度小于85%。A 级100 mL容量瓶的最大允许误差为±0.10 mL[15]，区间半宽度a3=0.10 mL，其服从三角分布，包含因子k= 6[16]。容量瓶在室温20 ℃检定，标准溶液的定容在(20±5)℃条件下进行。因为液体的体积膨胀系数远大于玻璃，因此只需考虑前者，甲醇的体膨胀系数为0.001 18/℃，产生的体积变化：±(100×5℃×0.001 18/ ℃)=±0.59 mL，则 区 间 半 宽 度a4=0.59 mL，按均匀分布，k= 3。标准物质纯度P、标准物质称量m0和定容体积V0引入的不确定度各分量结果列于表1。则100 mg/L 标准储备液配制引入的相对标准不确定度：

表1 标准储备液质量浓度引入的不确定度分量

标准溶液系列配制引入的相对标准不确定度。标准溶液系列配制是采用10 mL 刻度吸量管和100 mL 容量瓶进行稀释定容的；10 mL 分度吸量管(V1)容量允差为±0.05 mL，100 mL 容量瓶(V2)容量允差为±0.1 mL。按3.2.2 不确定度评定方法进行评定，10 mL 刻度吸量管和100 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度结果列于表2。配制10 mg/L 的标准使用液的相对标准不确定度urel(ρ10)由10 mL 分度吸量管引入的相对标准不确定度分量urel，1(V1)、100 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度分量urel，1(V2)和urel(ρ0)三个分量合成：

表2 量器引入的相对标准不确定度

由10 mg/L 标准使用液配制1.0 mg/L 的标准 溶 液，相 对 标 准 不 确 定 度urel(ρ1.0)由urel，2(V1)、urel，2(V2)和urel(ρ10)三个分量合成：

合成标准不确定度：uc(ρ1.0)=0.011 mg/L。

由标准物质配制系列标准溶液引入的标准不确 定 度 近 似 值[17]为u1(ρm)≈u(ρ1.0)/n≈0.002 1 mg/L(n为标准系列个数，n=5)

(2)标准工作曲线拟合引入的标准不确定度u2(ρz)。将系列标准溶液分别上机测定3 次，结果列于表3。

表3 系列标准工作溶液色谱峰面积

假设由标准溶液的吸收值(以色谱峰面积表示)与浓度拟合的标准曲线为y=bx+a，用最小二乘法拟合标准曲线方程：y=44.033 16x+0.135 52，r=0.999 8，表明标准曲线线性良好。根据标准溶液的浓度x，利用标准曲线计算得色谱峰面积的理论值ys，计算实际峰面积yi与理论值的残差(yi-ys)，按贝塞尔公式计算求得残差的标准偏差：

3.2.4 测量重复性引入的标准不确定度u(X1)

喹乙醇样品需经过绞碎、称量、提取、净化、浓缩、复溶等步骤后用液相色谱法检测，由于受光照、温度、人员操作、仪器误差等因素的影响，每一步都会引入不确定度，包括样品的均匀性和代表性、天平的重复性、定容体积的重复性等因素引入的不确定度，要依次确定每一步操作对测量结果不确定度的贡献是相当困难的，结合实际工作可采用检测方法验证的重复性结果进行评定。

3.3 合成标准不确定度u(X)和扩展不确定度

3.4 测量不确定度报告

取95%置信概率，包含因子k=2，则水产品中喹乙醇测定结果：X=(0.080±0.002) mg/kg。

4 结论

对高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量的不确定度来源进行全面分析，将各不确定度的分量进行比较，结果发现：

(1)样品溶液质量浓度引入的不确定度为该方法不确定度的主要来源，其中，标准工作曲线拟合引入的不确定度对测定结果不确定度的影响较大。其不确定度的大小，除了与标准溶液测量重复性有关，还与测试样品与标准溶液质量浓度平均值的接近程度有关，二者越接近，产生的不确定度就越小，因此实验设计时应考虑标准曲线的线性范围，测试样品的定量结果尽可能在落在标准曲线的中间，应适当增加样品和标准工作溶液平行测定次数(3～5 次为宜)；标准曲线实验点个数影响样品的不确定度，适当增加实验点将降低分析结果的测量不确定度。

(2)测量重复性引入的不确定度的影响次之，在测定过程中，仪器设备的重复性引入的不确定度贡献较大，为获得较小的不确定度，在测量过程中选用符合检测要求的仪器设备，同时增加平行检测次数，尤其是高效液相色谱，通过增加样品的重复测量次数达到减小不确定度的目的；除此之外必须严格控制实验条件，保持样品在提取、浓缩、净化等过程中的一致性，减少因环境和人员操作引入的偏差，并规范实验操作。

(3)标准溶液稀释过程中，温度误差和容量允差对不确定度的贡献较大，尤其是使用体膨胀系数较大的有机溶剂稀释时，温度误差引入的不确定度较容量允差显著；因此在标准溶液的配制过程中，控制室温20 ℃，减小温差，同时选用允差较小的量器。

(4)天平称量引入的不确定度：从天平的校准、重复性、分辨力和偏载误差四个方面评定天平称量引入的不确定度，对于分度值为0.01 g 的天平，允差对不确定度的贡献最大，对于分度值为0.01 mg 的天平偏载误差贡献最大；称量时，尽可能选用允差小的天平，标准物质的称量应考虑偏载误差。

(5)用1 000 μL 的流动相复溶残留物，1 000 μL 量器的允差大小对该分项不确定度影响最大，故选用校准的量器能减少该项不确定度。其它因素虽然影响较小，但仍需选取纯度较高的标准品，使用A 级玻璃量具，定期对天平及液相色谱仪等仪器进行维护保养与校准，进一步提高试验操作的规范性与测定结果的准确性。