LncRNA MEG3 和miR-21 在口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中的表达和临床意义

周晓丽，谷峰，郑雪莉

（河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471003）

口腔颌面部恶性肿瘤发病率较高， 可达3/10万，约占全身恶性肿瘤的8.2%[1]。 由于口腔颌面部结构复杂，血管和淋巴网络丰富，恶性肿瘤生长速度快且易转移，严重威胁患者生命健康[2]，因此早期诊断和治疗口腔颌面部恶性肿瘤对改善患者预后具有重要意义。 目前临床多采用影像学检查并结合患者临床症状来诊断口腔颌面部恶性肿瘤，易出现误诊和漏诊现象[3]，因此临床有必要寻找新的肿瘤标记物来帮助口腔颌面部恶性肿瘤的早期诊断。 长链非编码RNA （Long non-coding RNA，Lnc RNA）和微小RNA（MicroRNA，miRNA）是两类小分子非编码RNA，均参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[4]，同时其在血清中具有高度稳定性，是肿瘤早期诊断的潜在标记物[5]。 母体表达基因3（Maternally expressed gene 3，MEG3）是一种Lnc RNA， 位于人染色体14q32。 研究显示，MEG3 在非小细胞肺癌[6]、上皮性卵巢癌[7]等多种肿瘤组织中表达降低，其低表达与肿瘤转移、血管生成及患者预后密切相关， 在肿瘤的发生发展中起重要作用。 miR-21 位于染色体17q23.2，在宫颈癌[8]、胰腺导管癌[9]等组织中表达升高，可以促进肿瘤发生发展。 本研究即主要探讨MEG3 和miR-21在口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中的表达和临床意义， 以期为口腔颌面部恶性肿瘤的早期诊断提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016 年11 月至2018 年12月于本院就诊的72 例口腔颌面部恶性肿瘤患者（观察组）、72 例口腔颌面部良性肿瘤患者（良性对照组）、70 例健康体检者（健康对照组）作为研究对象。 观察组男性39 例，女性32 例；年龄34~69 岁，平均（53.24±8.79）岁；TNM 分期Ⅰ期11 例、Ⅱ期19 例、Ⅲ期26 例、Ⅳ期16 例；病理类型鳞状细胞癌39 例，粘液表皮样癌11 例，腺样囊性癌20 例，骨肉瘤2 例。 良性对照组男34 例，女38 例；年龄33~65 岁，平均（51.67±9.44）岁；涎腺混合瘤27 例、牙龈瘤22 例、纤维瘤16 例、淋巴管瘤7 例。 观察组与良性对照组纳入标准：（1） 均经手术病理证实；（2）术前未进行任何治疗；（3）未合并其他恶性肿瘤；（4）肝、肾等重要脏器功能正常；（5）无血液系统疾病。 健康对照组男性40 例，女性30 例；年龄30~70 岁，平均（55.35±9.14）岁。3 组研究对象在性别和年龄方面差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经本院伦理委员会批转同意， 患者或其家属自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 空腹采集研究对象静脉血5 mL于抗凝管中，3500 r/min 离心5 min，离心半径13.5 cm，取上清-80 ℃保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测血清中MEG3 和miR-21 表达水平 RNA 抽提试剂盒提取血清中总RNA，微量核酸仪检测RNA 的纯度和浓度。 RNA 溶液在260 nm 和280 nm 吸光度值（absorbance，A） 的比值A260 nm/A280 nm 处于1.8~2.0 范围内时，说明纯度较好。 参照逆转录试剂盒说明书，RNA 合成为cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增程序：95℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35 个循环。 引物序列：MEG3 上游5'-AAAGAGGGTGGATGCGCTAG-3'，下游5'- GACT ACACTCAGCC AGCGTA-3'；GAPDH 上 游5'-GTCGCCAAGCTGCGTGCG-3'，下游5'-CGC GAAGCTGCCTCTAAC T-3'；miR-21 上游5'-CGCGATAGTAGTGTAAACCGGC-3'， 下游5'-C GTGAACGCTGCTTGCCAAG TCG-3'；U6 上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。 MEG3以GAPDH 为内参，miR-21 以U6 为内参， 采用2－△△Ct法计算MEG3 和miR-21 的相对表达量。

1.3 统计学分析 利用SPSS 22.0 软件及EXCEL分析实验数据。 定量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及两两比较LSD-t 检验。相关性采用Pearson 相关性分析，诊断价值采用受试者工作特征（ROC）曲线分析。 P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组研究对象血清MEG3 和miR-21 相对表达量的比较 3 组研究对象血清MEG3 和miR-21 相对表达量比较差异有统计学意义（P＜0.01）。观察组血清MEG3 相对表达量显著低于良性对照组、健康对照组（P＜0.05），miR-21 相对表达量显著高于良性对照组、健康对照组（P＜0.05）；良性对照组血清MEG3 相对表达量显著低于健康对照组 （P＜0.05），miR-21 相对表达量显著高于健康对照组（P＜0.05）。 见表1。

表1 3 组研究对象血清MEG3 和miR-21 相对表达量的比较（±s）

表1 3 组研究对象血清MEG3 和miR-21 相对表达量的比较（±s）

分组观察组良性对照组健康对照组F 值P 值n MEG3 72 72 70 0.48±0.24 0.85±0.42 1.06±0.42 44.998<0.001 miR-21 1.86±0.55 1.29±0.58 1.03±0.43 46.627<0.001

2.2 病理类型对观察组患者血清MEG3、miR-21相对表达量的影响 观察组患者不同病理类型之间血清MEG3、miR-21 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。 见表2。

表2 病理类型对观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量的影响（±s）

表2 病理类型对观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量的影响（±s）

病理分型鳞状细胞癌粘液表皮样癌腺样囊性癌骨肉瘤F 值P 值n MEG3 39 11 20 2 0.48±0.23 0.47±0.21 0.48±0.25 0.40±0.39 0.090 0.965 miR-21 1.86±0.52 1.94±0.44 1.80±0.59 2.17±1.53 0.350 0.789

2.3 TNM 分期对观察组患者血清MEG3、miR-21相对表达量的影响 观察组Ⅰ~Ⅱ期患者血清MEG3 相对表达量显著高于Ⅲ~Ⅳ期患者， 血清miR-21 相对表达量显著低于Ⅲ~Ⅳ期患者 （P<0.001）。 见表3。

表3 TNM 分期对观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量的影响（±s）

表3 TNM 分期对观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量的影响（±s）

临床分期 nⅠ~Ⅱ期Ⅲ~Ⅳ期t 值P 值30 42 MEG3 0.69±0.13 0.32±0.19 9.226<0.001 miR-21 1.44±0.45 2.16±0.49 6.357<0.001

2.4 观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量的相关性分析 Pearson 相关分析显示， 观察组患者血清MEG3、miR-21 相对表达量呈显著负相关（r=-0.812，P<0.001）。 见图1。

图1 口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中MEG3 和miR-21 表达相关性

2.5 血清MEG3、miR-21 相对表达量及二者联合检测对口腔颌面部恶性肿瘤的诊断价值 单独检测血清MEG3、miR-21 相对表达量对口腔颌面部恶性肿瘤均具有较好的诊断价值（AUC＞0.7）。建立Logistic 回归模型将两指标转化得到联合检测预测概率的预测变量PRE_1， 并得到口腔颌面部恶性肿瘤预测值回归方程为：P=1/[1＋e-（-1.541-3.102X1＋2.077X2）]（X1、X2 分别为血清MEG3、miR-21 相对表达量），将每组两指标数据代入方程得到预测概率值P，若P 值≥预测变量PRE_1 的临界值即预测口腔颌面部恶性肿瘤。 联合检测的AUC 明显高于二者单独检测，差异均有统计学意义（Z=2.361，P=0.038；Z=2.219，P=0.041）。 见图2、表4。

表4 两个指标单一、联合检测诊断口腔颌面部恶性肿瘤的临床价值

图2 MEG3、miR-21 及二者联合检测诊断口腔颌面部恶性肿瘤的ROC 曲线

3 讨论

口腔颌面部恶性肿瘤预后较差， 因此早期诊断和治疗对口腔颌面部恶性肿瘤患者十分关键。近年来研究显示，多种Lnc RNA 和miRNA 在肿瘤患者体内异常表达，且血清Lnc RNA 和miRNA 表达稳定性较高， 可作为早期辅助诊断肿瘤的生物学标志物[10]。 MEG3 是一种Lnc RNA，参与肿瘤发生发展。 王艳等[11]研究显示，胃癌患者lncRNA MEG3 水平明显降低，与肿瘤发生和发展及预后密切相关。 而张旭等[12]研究发现，MEG3 在急性胰腺炎患者血清中呈低表达，其表达水平越低，患者病情越严重， 可作为区分轻症急性胰腺炎和重症胰腺炎的生物学标志物。另外，刘崇韬等[13]研究显示，急性心肌梗死患者早期血清MEG3 表达水平升高， 与血清血清肌酸激酶同工酶和心肌肌钙蛋白水平均呈正相关， 可能是潜在的急性心肌梗死早期诊断血清标志物。 上述研究表明，MEG3 在不同疾病中发挥的作用不同。

本研究显示，MEG3 在口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中表达较良性肿瘤及健康对照组显著降低， 与舌鳞癌等肿瘤组织中表达降低的结果一致[14]，提示MEG3 在口腔颌面部恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用。 此外，随着肿瘤TNM 分期升高，患者血清MEG3 相对表达量有所降低，提示血清MEG3表达水平可用于区分口腔颌面部恶性肿瘤患者肿瘤TNM 分期。 但是，不同病理类型口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中MEG3 相对表达量无显著差异，说明MEG3 不能用于区分肿瘤的病理类型。

另有研究显示，lncRNA 与miRNA 之间存在靶向调控关系[15]。 生物信息学软件预测显示，miR-21可能是MEG3 的靶基因。 姚丽华等[16]研究显示，miR-21 在食管癌患者外周血中表达升高， 其诊断食管癌的灵敏度高于传统食管肿瘤标志物。 李世荣等[17]研究显示，miR-21 在非小细胞肺癌患者血清中呈高表达，其诊断非小细胞肺癌的灵敏度、特异度分别为84.40 %和100 %，具有较高的诊断价值。 本研究结果显示，口腔颌面部恶性肿瘤患者血清miR-21 表达较良性肿瘤及健康对照组显著升高，且其高表达与TNM 分期密切相关，提示miR-21 表达升高促进口腔颌面部恶性肿瘤发展进程。

Zhang 等[18]研究显示，宫颈癌组织中MEG3 表达降低，miR-21 表达升高， 二者呈负相关，MEG3通过靶向下调miR-21 表达导致宫颈癌细胞增殖受到抑制和凋亡增加， 为宫颈癌的治疗提供了新的潜在靶点。 徐大伟等[19]研究显示，胶质瘤组织中MEG3 表达降低， 上调MEG3 表达通过靶向抑制miR-21 表达减弱胶质瘤U251 细胞的增殖、 侵袭和迁移能力。 本研究显示，口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中MEG3 和miR-21 相对表达量呈负相关，原因可能也与MEG3 在口腔颌面部恶性肿瘤患者中靶向负调控miR-21 表达有关。

最后，ROC 曲线分析结果显示，血清MEG3 诊断口腔颌面部恶性肿瘤的AUC、灵敏度、特异度和准确度分别为0.821、77.8%、70.4%、72.9%。 血清miR-21 诊断口腔颌面部恶性肿瘤的AUC、 灵敏度、 特异度和准确度分别为0.830、73.6%、77.5%、76.2%。 进一步绘制联合诊断ROC 曲线，结果显示两者联合检测的AUC、 特异度及准确度均较单独检测有不同程度提升， 说明联合检测MEG3 和miR-21 对口腔颌面部恶性肿瘤具有更高的诊断效能。

综上所述， 口腔颌面部恶性肿瘤患者血清中MEG3 呈低表达，miR-21 呈高表达， 两者呈负相关，且均与患者TNM 分期密切相关。 与单一指标相比， 两个指标联合检测对口腔颌面部恶性肿瘤具有更佳的临床诊断价值。