蛋鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病病毒混合感染的诊断

李汶蔓，韦 潼，吴文静，姜鸿睿，王雪柯，郭格言，李德龙,2*

(1.西南大学动物医学院，重庆 402460；2.西南大学医学研究院免疫学研究中心，重庆 402460)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的急性传染病，目前全国各地都有报道，严重危害养禽业发展[1-6]。禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)所引起的禽类传染病[7]，根据致病性可分为高致病性和低致病性两大类[8-9]。H9亚型为低致病性AIV，广泛分布于全国各地[10]。禽传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一种急性、高度接触性传染病，由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，ND、AIV和IBDV均有相应的商品化疫苗，而且许多养殖场也将这3种病毒疫苗作为强制疫苗进行免疫，但是近年来3种疫病仍在我国部分地区时有暴发，而且多呈混合感染[2,4-6,8]，因此仍有必要对3种疫病进行流行病学调查和综合诊断分析，以寻找防治疫病更好的措施。

2020年7月四川省内江市某蛋鸡养殖场暴发疫情，经驻场兽医诊断为IBD，紧急使用IBDV抗体治疗，效果不佳，该养殖场将病鸡送至西南大学动物医学院动物医院进行诊断，通过临床诊断及实验室检查，最终确诊为ND、H9亚型AI和IBD混合感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物与菌株 病鸡由四川省内江市某蛋鸡养殖场送至西南大学动物医学院动物医院进行综合诊断。大肠埃希氏菌DH5α由西南大学动物医学院兽医公共卫生与疾病控制实验室保存。

1.1.2 主要试剂 反转录试剂盒、rTaq酶以及连接酶Ligation Mix等均为大连宝生物工程有限公司产品；胶回收及质粒DNA纯化试剂盒，生工生物工程有限公司产品；NDV和AIV抗原检测卡(胶体金法)，深圳芬德生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 超净工作台，上海博讯实业有限公司产品；高速台式离心机，Sigma公司产品；PCR扩增仪，BIO-RAD公司产品；凝胶分析成像系统，上海天呈科技有限公司产品；恒温数显水浴锅，国华电器有限公司产品；切片机，德国Leica公司产品。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断和胶体金法检测 对鸡场疾病流行情况及病死鸡剖检病变进行询问、观察。按照深圳芬德生物技术有限公司的NDV和AIV抗原检测卡(胶体金法)说明书，对病鸡咽拭子样本进行检测。

1.2.2 病理组织学诊断 尸体剖检后采集心脏、肝脏、脾脏等各主要器官，100 mL/L福尔马林溶液进行固定，制作石蜡切片及HE染色，显微镜下观察。

1.2.3 PCR检测 采集病鸡咽拭子、肝脏、法氏囊、脾脏，按常规方法匀浆，反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液备用。根据NCBI NDV、AIV和IBDV的全基因序列设计引物(表1)。提取病毒RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s,30个循环；72℃ 10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。目的基因分别与pMD19-T载体连接，转化入DH5α，37℃过夜培养，挑菌，摇菌，提取质粒，送公司测序。

表1各病毒检测引物序列

2 结果

2.1 流行病学

2020年7月，四川内江某蛋鸡养殖场4万余只白来航蛋鸡陆续发病。27日龄时，偶见零星死亡，无可见症状，抗生素治疗无效。28日龄时死亡400余只，经驻场兽医诊断为IBD感染，使用IBDV抗体进行紧急免疫，效果不佳，29日龄死亡500余只，2 d共死亡1000余只。

2.2 临床检查

送检病鸡精神沉郁，被毛粗乱，体型消瘦，伏地不起，少数站立但不愿走动，叫声低沉，肛周羽毛被粪便污染，拉黄绿色稀粪。

2.3 胶体金试纸条对新城疫和禽流感检测结果

利用NDV和AIV胶体金进行检测，结果表明，NDV和AIV均为阳性(图1)。

图1胶体金试纸条对新城疫和禽流感的检测结果

2.4 剖检病变

心脏血管怒张(图2A)。肝脏体积轻微肿大，颜色呈暗红(图2B)。肾脏呈暗红色(图2C)。腿肌出血(图2D)。腺胃乳头轻度肿胀，刀刮有刮不净的感觉(图2E)。法氏囊体积肿大(图2F)。空肠淋巴滤泡和盲肠扁桃体肿胀，胰腺有针尖大白色坏死点。

2.5 组织病理学病变

心脏心肌纤维间有部分炎性细胞浸润(图3A)。肝脏中央静脉及部分肝窦内充满红细胞(图3B)。脾脏动脉周围淋巴鞘散在分布有红细胞(图3C)。肺脏三级支气管内充满大量纤维素及炎性细胞(图3D)。肾脏肾小管上皮细胞变性，坏死，间质内有炎性细胞浸润(图3E)。法氏囊囊小结内细胞核浓缩，着色较深，淋巴细胞数量减少，部分囊小结周围有异嗜性粒细胞浸润(图3F)。空肠绒毛部分断裂，固有层淋巴细胞增多；盲肠部分绒毛断裂，盲肠扁桃体内淋巴细胞数量增多(图3G，3H)。脑出现血管套现象，部分神经元发生坏死，形成卫星现象和噬神经现象(图3I)。腺胃固有层内淋巴细胞数量增多(图3J)。

A.心脏；B.肝脏；C.肾脏；D.腿肌；E.腺胃；F.法氏囊A.Heart; B.Liver; C.Kidney; D.Crureus; E.Glandular stomach; F.Bursa of Fabricius

2.6 PCR鉴定

提取病毒RNA，反转录成cDNA后，分别用NDV、AIV(2对)和IBDV特异性引物进行PCR扩增，分别得到4个片段，与预期目的基因大小一致(图4)。将3个目的基因(535 bp、488 bp和720 bp)分别与pMD19-T载体连接后，转化至大肠埃希氏菌DH5α，挑取阳性克隆经PCR鉴定后送公司测序，测序结果经NCBI Blast比对分析后显示，3个片段分别与NDV(GenBank登录号KF306265.1)、H9亚型AIV(GenBank登录号MN759635.1)和IBDV(GenBank登录号MT179721.1)相似性最高。

3 讨论

根据流行病学特征、临床检查、剖检诊断、病理组织学检查和病原学检查等综合诊断，最终确定这是一起蛋鸡ND、H9亚型AI和IBD混合感染病例。该养殖场病例发病急，发病率高，初期死亡率高，后期死亡率趋于稳定，给养殖户带来严重的经济损失。

在本病例中，养殖场已按照严格的蛋鸡免疫程序进行免疫，但依旧暴发疫情，分析其可能原因如下：其一，该场免疫程序陈旧，长期以来未对养殖场周边疫情进行流行病学调查，且按照旧程序进行免疫后，未及时对鸡群抗体水平进行检测；其二，该场基层兽医诊断技术落后。在疫情暴发初期，由于养殖场基层兽医诊断技术和经验不足，未能在第一时间对疫情进行准确的诊断，只是单纯用了一些常规抗生素进行治疗，虽然紧急使用了IBDV抗体，但是由于未进行准确诊断，因此效果不佳，延误了治病最佳时间，导致疫情在鸡群中蔓延，给养殖场造成了较为严重的经济损失。

A.心脏；B.肝脏；C.脾脏；D.肺脏；E.肾脏；F.法氏囊；G.空肠；H.盲肠扁桃体；I.脑；J.腺胃A.Heart; B.Liver; C.Spleen; D.Lung; E.Kidney; F.Bursa of Fabricius; G.Jejunum; H.Cecal tonsil; I.Brain; J.Glandular stomach

A.NDV PCR鉴定结果；B～C.AIV PCR鉴定结果；D.IBDV PCR鉴定结果；M.DNA标准DL 2 000；1.新城疫病毒；2.阴性对照；3.A型流感病毒；4.阴性对照；5.阴性对照；6.H9亚型AIV；7.H7亚型AIV；8.H5亚型AIV；9.法氏囊病毒；10.阴性对照

目前ND主要疫苗株为LaSota弱毒株，基因型为Ⅱ型，而我国流行毒株主要是Ⅶ型[15]，流行株与疫苗株基因型不匹配，是造成临床非典型症状多发的主要原因之一，而此次检测到的NDV也是Ⅶ型，同样说明存在这种情况。H9亚型AIV是一种低致病力AIV，家禽感染后通常情况下不会造成死亡，会有相应的轻度流感症状产生。但是低致病性AI易伴随ND、大肠埃希氏菌等发生继发感染[16]。IBD是一种急性、高度接触性传染病，同时该病也是一种免疫抑制病，鸡感染后会损伤法氏囊，从而导致机体免疫应答反应降低，使疫苗免疫的效果降低，本研究检测到的病例为ND、H9亚型AI和IBD混合感染，病原复杂，疫情紧急，又因养殖场疫苗免疫和临床诊断等工作存在漏洞，导致病死鸡数量较多，经济损失较大。

总之，养殖场应尽快尽早进行周边疫病的流行病学调查分析，按照本地实际情况制定适合本场的免疫程序，同时在免疫后，及时监测鸡群血清中的抗体水平；加强对基层驻场兽医技术培训，以便在疫病发生初期进行及时准确地诊断，对因对症治疗，以免造成更大的经济损失。