鸭疫里默氏菌贵州分离株OmpA基因的克隆及生物信息学分析

马光强，刘丽娟，陈国权，吴良涛，杨 均，刘军泽，李潇蒙，潘成文，周碧君*

(1.黔南民族职业技术学院，贵州都匀 558000；2.都匀市农业农村局，贵州都匀 558000；3.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025)

鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)为里氏杆菌科黄杆菌属，革兰氏阴性菌，能引发家鸭、野鸭、雏鹅、火鸡等多种禽类发生以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为主要特征病变的急性或慢性、接触性、败血性传染病[1-4]。该病是目前危害养鸭业最主要的细菌性传染病之一，患病鸭感染率及病死率高，生长缓慢，品质下降，饲料报酬率低，治疗难度增大，给养鸭业造成巨大经济损失[5]。用抗菌药物是治疗该病的主要措施，而滥用抗菌药物致使RA易产生多重耐药性，用疫苗免疫预防是比较安全有效的途径[6]。

外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的重要成分，在维持细菌形态、调节物质合成、跨膜转运、信号转导及诱导机体产生免疫应答等方面具有重要作用[7-8]。外膜蛋白A(OmpA)是细菌外膜蛋白的主要成分，在维持细菌结构的完整性、参与黏附侵袭宿主和逃逸宿主防御机制中发挥重要作用[9]。RA的OmpA包含6个EF-hand钙结构域和2个PEST结构域，OmpA可能是潜在致病因子的结构基础[10]。Th4ΔOmpA对Vero细胞的黏附能力、血液载菌量和对雏鸭的致病力较亲本株显著下降，表明OmpA可能是RA的重要毒力因子[11]。OmpA有4个胞外环状分子暴露在细胞表面且该蛋白基因序列高度同源，可能具备良好保守性与免疫原性，适合作为新型疫苗研制的候选蛋白[12]。为明确RA贵州分离株OmpA基因特性和遗传特征，本试验克隆OmpA基因并对其进行原核表达，分析其生物信息学功能，以期为进一步研究RA OmpA蛋白的功能和基因工程亚单位疫苗的候选蛋白筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体 13株RA贵州分离株包括RA-SS-1-12于2018年-2019年分离于贵州省三穗县，RA-AS-1于2019年分离于贵州省安顺市，由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室分离保存；大肠埃希氏菌DH5α购自北京擎科生物科技有限公司；pMD19-T载体，购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂 无菌脱纤维绵羊血，南京便诊生物科技有限公司产品；胰酪大豆胨液体培养基，杭州微生物试剂有限公司产品；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司产品；酵母粉和胰蛋白胨，OXOID公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒和2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技(北京)有限公司产品；DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、连接酶Solution Ⅰ、限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，均为TaKaRa公司产品；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒和 Plasmid Kit质粒提取试剂盒，Omega公司产品；氨苄青霉素，北京索莱宝科技有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司产品；台式高速冷冻离心机，丹麦LABOGENE公司产品；双人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；二氧化碳培养箱和电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；全温培养摇床，上海新苗医疗器械制备有限公司产品；多功能梯度PCR仪，美国ABI公司产品；Implen微量核酸测定仪，德国Implen公司产品；电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；全自动数码凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品；颗粒制冰机，美国Grant公司产品；迷你离心机，丹麦Scanspeed公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中公布的RA Yb2株OmpA基因序列(登录号：CP007204)，用Primer Premier 5.0设计1对特异性引物，上游引物为OmpA-F：5′-CGCGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3′(下划线处为BamHⅠ酶切位点)，下游引物为OmpA-R：CCCAAGCTTTTATTTTCTTTTCTTTTTTACT ACT(下划线处为Hind Ⅲ酶切位点)，预扩增片段大小为1 164 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2OmpA基因的克隆 应用OmpA基因特异性引物，以13株RA贵州分离株基因组DNA为模板，PCR扩增OmpA基因。PCR反应体系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 70 s，35个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 载体构建及测序 PCR产物用12 g/L琼脂糖凝胶检测分离，将目的DNA片段进行胶回收纯化。pMD19-T载体用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切产物，将回收的OmpA基因片段按pMD19-T载体说明书操作方法进行连接，连接反应体系10 μL：Solution Ⅰ 5 μL，目的基因纯化产物4 μL，pMD19-T载体1 μL，16℃连接过夜。取10 μL连接产物与100 μL大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞混合，冰上孵育30 min后42℃热激45 s，迅速置于冰上作用3 min，加入890 μL LB液体培养基，37℃、160 r/min培养1 h进行复苏。复苏结束后取100 μL菌液涂布于含有Amp(终浓度为100 μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。挑平板中的单菌落接种于5 mL含有Amp(终浓度为100 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养12 h。以菌液DNA为PCR模板，按1.2.2中的PCR反应体系进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.4 生物信息学分析 用Blast(NCBI)和DNAStar软件对13株RA贵州分离株OmpA基因序列与参考序列进行核苷酸同源性和遗传进化分析(表1)；分别用在线软件Protparam和Protscale分析预测RA OmpA蛋白的理化性质及氨基酸组成和亲水性；分别用在线软件TMHMM server v.2.0和SignalP-5.0分析预测RA OmpA蛋白的跨膜结构和信号肽；分别用DNAStar软件包Protean提供的Kyte-doolittle法、Karplus-schulz法、Emini法和Jameson-wolf预测RA OmpA蛋白B细胞抗原表位的亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数；分别用在线软件SOPMA和SWISS-MODEL预测RA OmpA蛋白的二级结构和三级结构。

表1 RA参考株OmpA基因序列信息

2 结果

2.1 RA贵州分离株OmpA基因PCR扩增

以13株RA贵州分离株基因组DNA为模板，用RAOmpA基因特异性引物进行PCR扩增，经电泳检测。结果显示PCR产物大小约为1 164 bp，与预期扩增片段大小相符(图1)。

2.2 RA贵州分离株OmpA基因重组质粒PCR鉴定

将构建的13株RA贵州分离株OmpA基因重组克隆质粒进行PCR鉴定，经电泳检测。结果显示，PCR产物大小约为1 164 bp，与预期扩增片段大小相符(图2)。

M.DNA标准 DL 2 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.阴性对照；+.阳性对照M.DNA Marker DL 2 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.Negative control；+.Positive control

M.DNA标准DL 2 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.阴性对照；+.阳性对照M.DNA Marker DL 2 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.Negative control；+.Positive control

2.3 RA贵州分离株OmpA基因重组质粒双酶切鉴定

用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对13株RA贵州分离株OmpA基因的重组克隆质粒进行双酶切鉴定，经电泳检测。结果显示，得到大小约为2 692 bp的pMD19-T载体片段和大小约为1 164 bp的RAOmpA基因片段(图3)。表明RAOmpA基因已成功插入pMD19-T克隆载体，且测序结果与预期结果相符。

2.4 RA OmpA基因同源性及进化分析

用DNAStar的MegAlign软件，对13株RA贵州分离株OmpA基因序列与GenBank上登录的RA参考株相应序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化树分析。结果显示，13株RAOmpA基因核苷酸同源性为100%，与参考株OmpA基因核苷酸同源性为93.0%～100%；13株RAOmpA基因与GZ-RA8(KY399239)、GZ-RA9(KY399240)、GZ060302(EF408264)、SD-RA2018(MK676082)、Yb2(CP007204)株的同源性高达100%(图4)。RA分离株OmpA基因遗传进化树分析发现，13株RAOmpA基因与参考株处于同一大分支，其中13株RAOmpA基因与SD-RA2018(MK676082)、Yb2(CP007-204)、GZ060302(EF408264)、GZ-RA9(KY399240)、GZ-RA8(KY399239)株处在同一小分支，亲缘关系较近；与中国台湾分离株TRa9(AY606222)处于较远的亲缘关系(图5)。结果表明，13株RA贵州分离株OmpA基因高度保守。

M.DNA标准DL 5 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1M.DNA Marker DL 5 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1图3 RA OmpA基因重组质粒双酶切鉴定结果

2.5 RA OmpA蛋白理化性质分析

RAOmpA基因开放阅读框为1 164 bp，共编码387个氨基酸，分子质量约为41.8 ku，理论等电点(pI)为4.89，预测其蛋白分子式为C1840H2854N502O588S12；正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)45个，负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)58个；蛋白的不稳定指数为20.58，推测该蛋白为稳定蛋白；脂肪指数为68.79，亲水性的平均值为-0.552，推测该蛋白为亲水性蛋白。用在线软件ProtScale预测RA OmpA氨基酸序列的亲疏水性，纵轴大于0为疏水区，分值越高疏水性越强；反之，小于0则为亲水区。结果显示，RA OmpA蛋白在第9位氨基酸分值最高(1.83)，具有最强疏水性；在第351位氨基酸分值最低(-3.21)，具有最强亲水性。该蛋白除局部为疏水区域外，大部分均为亲水区域，表明该蛋白属于亲水性蛋白，符合成为优势抗原的条件(图6)。

2.6 RA OmpA蛋白跨膜结构和信号肽预测

用在线软件TMHMM Server v.2.0、SignalP-5.0对RA OmpA蛋白的跨膜区域和信号肽进行预测分析。RA OmpA蛋白无跨膜结构域(图7)；此蛋白无信号肽，即为非分泌蛋白(图8)。

图4 RA OmpA基因核苷酸同源性分析结果

图5 RA OmpA基因核苷酸序列的遗传进化树

2.7 RA OmpA蛋白B细胞抗原表位预测

用Protean软件对RA OmpA蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数进行分析。结果显示，RA OmpA蛋白具有良好的亲水性；柔韧性分布较为均匀；表面可及性和抗原指数偏高，且在61-73、125-132、233-244、264-275、344-354、380-387肽段表面可及性和抗原指数较高(图9)。

图6 RA OmpA蛋白亲/疏水性预测结果

图7 RA OmpA蛋白跨膜结构预测结果

图8 RA OmpA蛋白信号肽预测结果

图9 RA OmpA蛋白B细胞抗原表位预测结果

2.8 RA OmpA蛋白二级结构和三级结构预测

用在线软件SOPMA对RA OmpA蛋白的二级结构进行预测分析。结果显示，该蛋白由59.17%(229/387)的无规则卷曲、18.86%(73/387)的α-螺旋、15.50%(60/387)的延伸链和6.46%(25/387)的β-转角构成(图10)。该蛋白的二级结构主要以无规则卷曲为主，有利于与其周围的极性环境相接触，为抗原表位的形成创造了有利条件。应用SWISS-MODEL在线软件对RA OmpA蛋白的三级结构进行预测分析，该蛋白的三级结构主要包括无规则卷曲、α-螺旋和延伸链，与二级结构预测结果相符(图11)。

图10 RA OmpA蛋白二级结构预测结果

图11 RA OmpA蛋白三级结构预测结果

3 讨论

外膜蛋白A(OmpA)是革兰氏阴性菌中外膜蛋白(OMPs)的主要成分，是介导细菌生物膜形成、真核细胞感染、抗菌药物抗性和免疫调节的关键毒力因子[13]。相关文献表明，OmpA在参与RA黏附和侵袭宿主细胞以及诱导宿主产生免疫应答过程中起关键作用[11]。近年来，鉴于OmpA具有良好的免疫原性，将OmpA用于亚单位疫苗开发已成为当前研究的热点。本试验应用分子克隆技术对13株RA贵州分离株OmpA基因进行克隆分析，经测序发现13株RAOmpA基因片段大小均为1 164 bp，其同源性达100%；与参考株GZ-RA8、GZ-RA9、GZ060302、SD-RA2018和Yb2株的同源性高达100%，与文献[14-15]研究结果一致。表明众多RA血清型菌株均含有OmpA基因序列，且具有高度的同源性和保守性。

抗原表位也称抗原决定簇，是指外源抗原分子激发免疫机体产生免疫应答的最基本结构，广泛用于新型疫苗研制、单克隆抗体制备、诊断试剂和药物开发等[16]。B细胞抗原表位是指抗原分子表面可被B细胞表面受体或抗体特异性识别并结合的化学基团[17]。随着生物信息学与免疫信息学等交叉学科的快速发展和不断成熟，应用生物信息学技术预测和筛选蛋白的B细胞抗原表位已成为主要研究方法。应用生物信息学预测B细胞抗原表位一般包括3个参数，即亲水性、柔韧性和表面可及性。亲水性大小与B细胞抗原表位数量正相关，柔韧性强弱与B细胞受体结合能力正相关，表面可及性大小与B细胞受体识别并结合的难易程度正相关。本试验应用生物信息学技术对RA OmpA蛋白B细胞抗原表位进行预测，根据多参数综合分析OmpA可能存在的优势抗原位点。预测结果显示，OmpA蛋白在61-73、125-132、233-244、264-275、344-354、380-387肽段具有良好的B细胞抗原表位。表明RA OmpA蛋白具有较多的优势抗原表位结构，可初步应用于免疫学相关研究。本试验结果为基于RA OmpA蛋白的亚单位疫苗研制奠定了基础。