方竹笋中氨基酸总量测定方法的研究*

龙昭航，陈 美，邓雪薇，王 海，孙 姣

(贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550000)

桐梓县方竹笋被列为贵州省特色优质绿色农产品[1]，是中国国家地理标志产品，方竹笋形态方正，肉厚鲜美，具有鲜、香、嫩、脆的品质，被誉为“笋中之王”。含有丰富的蛋白质，富含多种氨基酸和多种矿物质元素，具有较高的食用价值[2-3]。近几年来，对方竹笋成分的挖掘及产品的开发技术的研究普遍受到关注[4-5]。

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，在动物的营养中起到重要作用。人体所需要的必需氨基酸多数都由食物所供给，方竹笋中氨基酸含量丰富并且种类齐全，目前检测到的有17种氨基酸，其中人体必需氨基酸有7种，占氨基酸总量的39.9%[6]。对氨基酸检测的方法有滴定法、分光光度法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪法等[7-8]。滴定法干扰因素较多，结果准确度不高；高效液相色谱法、氨基酸分析仪法检测结果准确，但操作较繁琐、耗时，费用较高；分光度法较简便迅速，费用较少，应用较广泛。目前对游离氨基酸的研究比较多，但缺乏对水解氨基酸总量的直接测定方法的研究[9-10]，本文以酸水解法获取方竹笋中的氨基酸，采用茚三酮分光光度法测定方竹笋中氨基酸总量，建立一种准确、简捷的方竹笋中氨基酸总量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-谷氨酸标准品(C5H9NO4，CAS号56-86-0，纯度≥99.0%)、17种氨基酸混标(100 nmol/mL)；苯酚、氯化亚锡、盐酸、茚三酮、无水磷酸氢二钠(KH2PO4)、十二水磷酸二氢钠(Na2HPO4·12H2O)、柠檬酸钠，实验试剂为分析纯；实验室用水为GB/T 6682规定的三级水。

实验用试样方竹干笋来源贵州省桐梓县、重庆金佛山区域。取不少于200 g方竹干笋剪成小块，在80 ℃干燥箱中烘4 h，于干燥器中冷却至室温，立即用粉碎机粉碎。样品要求全部通过孔径为0.5 mm的筛，过筛后的样品密封保存，备用。

1.2 仪器与设备

723S型可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪，Agilent；XSE205DU型电子天平，梅特勒-托利多；电热鼓风恒温干燥箱；DK-98-ⅡA型恒温水浴锅；实验室用组织粉碎机；浓缩仪；水解管等实验室常用仪器。

1.3 方法

1.3.1 试剂溶液制备

盐酸溶液(6 mol/L)：取500 mL盐酸加水稀释至1000 mL，混匀；磷酸盐缓冲液(pH8.0)：称取2.2705 g十二水磷酸二氢钠、0.0454 g无水磷酸二氢钾，加80 mL水溶解，调节pH值至8.0，加水定容至100 mL，摇匀；茚三酮溶液(2%)：称取茚三酮2.0 g、氯化亚锡(SnCl·2H2O)80 mg，加适量水搅拌溶解，置于避光处24 h，过滤，加水至100 mL，避光保存。

1.3.2 标准溶液的制备

L-谷氨酸标准储备液(10 mg/mL)：称取0.5 g L-谷氨酸标准品，加适量水溶解，加水定容至50 mL，摇匀备用； L-谷氨酸标准系列工作液：移取0.0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL标准储备液分别置于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。该系列标准工作液中的L-谷氨酸浓度分别为0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL。

1.3.3 试样溶液的制备

准确称取0.1 g制备好的试样(精确至0.0001 g)，置于洁净干燥的氨基酸水解管底部。沿水解管内壁加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，滴加苯酚3滴～4滴，封口，将已封口的水解管置于电热鼓风恒温干燥箱内，在110 ℃下水解24 h，取出，待水解液冷却至室温，过滤，水解管用少量水重复冲洗，滤液和水洗液并入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀。

1.3.4 试样的测定

准确吸取1.0 mL“1.3.3”试样溶液移人到25 mL比色管内，用浓缩仪在45 ℃减压干燥至盐酸挥发完全，加1 mL水溶解残留物，加0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)和0.5 mL茚三酮溶液(2%)，置沸水浴中加热15 min，冷却，加水定容至25 mL，放置10 min，用5 mm比色皿，在最大吸收波长568 nm处，测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

准确吸取1.00 mL浓度为0.4 mg/mL的L-谷氨酸标准溶液于25 mL比色管中，按“1.3.4”项的操作方法进行显色操作，以试剂空白溶液作参比，在可见分光光度计可见光区420～800 nm进行扫描，确定反应体系的最大吸收波长，结果如图1所示。

图1 L-谷氨酸最大吸收波长扫描Fig.1 Scanning under maximum absorption wavelength of L-glutamic acid

由图1可知，茚三酮分光光度法测定氨基酸总量反应体系在568 nm处有最大吸收，确定最佳测定波长为568 nm。

2.2 标准曲线的绘制

分别准确吸取1.00 mL L-谷氨酸标准系列工作液置于25 mL比色管中，按“1.3.4”项的操作方法进行显色操作，以试剂空白溶液作参比，在568 nm波长处测定吸光度值。以L-谷氨酸质量浓度(mg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果如图2所示。

图2 L-谷氨酸标准曲线Fig.2 Standard curve of L-glutamic acid

由图2可知，标准曲线回归方程：y=1.4936x+0.0021，R2=0.9998；表明L-谷氨酸在0.1～0.60 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.3 稳定性试验

精密吸取1.00 mL制备好的试样溶液“1.3.3”，按“1.3.4”项的操作方法进行显色操作，于568 nm波长处，每隔5 min测定其吸光度，见表1。测定试样显色溶液吸光度在1 h内的变化情况，如图3所示。

图3 试样显色溶液吸光度在1h内的变化情况Fig.3 Change of absorbance of sample color solution within 1 h

表1 稳定性试验结果Tab.1 Stability test results

由表1、图3可知，试样显色溶液在1 h内吸光度RSD为0.60%，表明该方法稳定性较好，试样显色溶液在1 h内基本稳定。吸光度在10 min达到峰值并趋于稳定，30 min后出现下降趋势，因此显色后应在30 min内完成测定，该方法选择放置10 min，进行测定。

2.4 精密度试验

2.4.1 仪器精密度试验

取浓度为0.4 mg/mL的谷氨酸标准品溶液1.00 mL，按“1.3.4”的方法进行显色操作，测定吸光度，连续测定6次，计算RSD，结果见表2。

表2 仪器精密度试验结果Tab.2 Instrument precision test results

2.4.2 方法精密度试验

取同一份制备好的试样溶液1.00 mL，共6份，按“1.3.4”的方法进行显色操作，测定吸光度，计算RSD，结果见表3。

表3 方法精密度试验结果Tab.3 Method precision test results

由表2、表3可知，仪器精密度试验RSD值为0.06%，方法精密度试验RSD值为0.30%，表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验

准确称取制备好的方竹笋试样0.1000 g，共6份，按“1.3.3”制备试样溶液，按“1.3.4”项的操作方法进行显色，测定吸光度，并计算氨基酸总量，结果见表4。

表4 重复性试验结果Tab.4 Repeatability test results

由表4可知，氨基酸总量平均值为29.42%，RSD为0.38%，表明该方法重复性较好。

2.6 加标回收率试验

准确称取制备好的方竹笋试样0.1000 g，按“1.3.3”制备试样溶液，按“1.3.4”项的操作方法进行显色，进行3个不同浓度点的三水平加标回收试验，结果见表5。

由表5可知，9次加标回收试验的加标回收率在96.86%～102.24%之间，平均回收率为98.73%。表明采用该方法测定方竹笋氨基酸总量的准确度良好。

2.7 试样中氨基酸总量的测定

2.7.1 茚三酮分光光度法

选取3个方竹笋样品，精密称取6份，按“1.3.3”制备试样溶液，按“1.3.4”项的操作方法进行显色，测定吸光度，并计算氨基酸总量，结果见表6。

由表6可知，采用茚三酮分光光度法对3个方竹笋样品进行检测，得到3个方竹笋样品中氨基酸总量分别为35.97%、33.34%、38.19%。

2.7.2 高效液相色谱法

称取“2.7.1”选取的方竹笋样品，按“1.3.3”制备试样溶液，采用高效液相色谱仪对试样溶液进行17种氨基酸含量的测定，并进行加和计算氨基酸总量。

由图4、表7可知，采用高效液相色谱法对3个方竹笋样品进行17种氨基酸的检测，可以检测到氨基酸种类有16种，进行加和计算得到3个方竹笋样品中氨基酸总量分别为32.50%、31.26%、36.06%。

图4 方竹笋氨基酸色谱图Fig.4 Chromatogram of amino acids in square bamboo shoots

表7 高效液相色谱法测定结果(单位：%)Tab.7 Determination results by HPLC

综上，试验结果表明，茚三酮分光光度法比高效液相色谱加和计算法测得的氨基酸总量高出2.0%～3.5%。

3 结论

本文对茚三酮分光光度法测定方竹笋氨基酸总量进行了方法学研究，并与高效液相色谱法结果进行了比较。结果表明，本方法在浓度0.1～0.60 mg范围内，相关系数为0.9998，平均加标回收率为98.73%，RSD=0.38%(n=6)，本实验测得的结果与高效液相色谱法相比高出2.0%～3.5%。该方法简便、重复性好、准确度高，可应用于方竹笋氨基酸总量的测定，为方竹笋品质研究提供有效手段。