贵州产油麻血藤总黄酮含量测定方法的建立与研究

杨从武，罗九凤

(1黔东南苗族侗族自治州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556011；2贵州医科大学第二附属医院(原418医院)，贵州 凯里 556000)

油麻血藤是我省少数民族药材，为豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤茎，全年均可采收，除去枝叶切段或片，晒干。常春油麻藤也被命名为棉麻藤、牛马藤、常绿油麻藤[1]。该药材绝大部分生长于我国34.5° N以南，并且在海拔300～3000 m地区分布较为广泛，重点涵盖了贵州、甘肃等地区[2]，在贵州重点分布于黔东南州、黔西南州和黔南州等地。油麻血藤从客观的角度而言可划分为鸡血藤，能够发挥补血的效果，有效促进血液循环，对多种病症都具有适用性，其中比较主要的包括风湿疼痛、血虚等，然而和鸡血藤进行对比，油麻血藤更加偏向于滋补强壮，而且具有更为理想的口感[3]。成分指标为：脂肪酸占1%～10%[4]、总黄酮类占12.43%[5]、酚类、蛋白质[6]、七个成分一致的挥发油(比较主要的包括3-辛醇、β-紫罗兰酮等)[7]。目前载于《贵州省中药材质量标准》2003版中[8]，其只有性状鉴定内容，不能更好地控制其质量，因此，还有待于提高和完善。

1 材料与仪器

1.1 药材

三批样品分别采自贵州凯里、兴义、荔波。经鉴定为豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤茎，相关的凭证标本储存在贵州中医药大学的生药实验室。

1.2 仪器

紫外光度计UV-2600、UV-2700；超声波清洗器(219J0340，500 W，53 kHz)；电热恒温水浴锅单列六 5L(DK-98-ⅡA型)；500 克摇摆式高速中药粉粹机；XPE205型电子天平；鼓风干燥箱。

1.3 试剂

芦丁标准物质(中检院，92.4%(UV)；10080-201811)；甲醇(川东化工试剂公司，AR)；95%乙醇(西陇科学公司，AR)；乙酸乙酯(川东化工试剂公司，AR)；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等购自国药集团化学试剂公司，均为AR。

2 方法与分析

2.1 干燥油麻血藤样品的制备

取凯里、兴义、荔波产油麻血藤试样1000 g，切厚片，于干燥箱50 ℃下烘干，放冷至室温，打粉过四号筛，密封存储于广口瓶中，备用。

2.2 标准溶液的制备

称取标准物质0.01175 g(芦丁)，用85%甲醇适量，超声充分溶解为0.21714 mg/mL标准溶液。

2.3 测定波长的确定

取2.2项下溶液3.00 mL，将其置于25 mL量瓶中，照2.4项下方法，从“加水至6 mL”起依法操作，照中国药典2015年版四部0401[11]，在760～200 nm区间，记录图谱，确定最大吸收波长为510 nm，结果见图1。

图1 对照品溶液光谱图Fig.1 Spectrogram of the reference solution

2.4 标准曲线的制备

量取2.2项下溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL，各置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min[9]，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min[9]，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min[9]，即得。立即在 510 nm 处测定各个溶液的吸光度，其吸光度分别为：0.106，0.219，0.334，0.458，0.580，0.703，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[10]。其回归方程为Y=0.01379X-0.01920，r=0.99966，在测定浓度为8.686～52.114 μg/mL范围内线性关系良好，可以进行定量分析，结果见图2。

图2 芦丁标准物质溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

2.5 样品溶液的配制

精密称取荔波产油麻血藤粉末约0.25 g，将其置具塞锥形瓶中，精密加入85%甲醇100 mL，称重，超声30 min，冷却再称重，用85%甲醇进行补重，摇匀滤过，量取续滤液5.00 mL置25 mL 量瓶中，照2.4项下方法，自“加水至6 mL”起依法操作，并测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量。

2.6 方法学验证

2.6.1 重复性试验

精密称取荔波产油麻血藤各约0.25 g，共6份，照2.5项下依法操作，计算总黄酮量，重复性试验结果见表1，RSD=0.96%(n=6)<1.5%，该方法的重复性良好。

表1 重复性试验结果Tab.1 Repeatability test results

2.6.2 中间精密度试验

在与重复性不同的实验时间(不是同一天)，精密称取荔波产油麻血藤3份，各约0.25 g，照2.5项下方法操作，计算总黄酮量，结果见表2，RSD=0.53%<3.0%，该方法的精密度良好。

表2 中间精密度试验结果Tab.2 Intermediate precision test results

2.6.3 加样回收率试验

精密称取与重复性同一批荔波产油麻血藤约0.15 g，6份，添加与芦丁本底含量相当的对照品，照2.5项下方法操作，计算总黄酮量，结果见表3，平均回收率达到99.97%，RSD<3%，符合检测要求。

表3 加样回收率试验结果Tab.3 Spiked recovery rate test results

回收率%=( C-A )/B×100%

式中，A指代的是本底含量；B 指代的是加入对照品量；C 指代的是实测值。

2.6.4 供试品溶液稳定性试验

精密称取荔波产油麻血藤约0.25 g，照2.5项下方法操作，先后在0 min、15 min、30 min时测定。得到的数据见表4，RSD<3%，这说明该溶液在半小时内稳定性十分理想。

表4 稳定性试验结果Tab.4 Stability test results

2.6.5 不同型号仪器试验

精密称取荔波产油麻血藤3份，各约0.25 g，照2.5项下方法操作，选取2个紫外分光光度计，其型号必须有所区别，此后进行测定操作，得到的结果见表5，RSD<3%，表明不同的紫外分光光度计检测分析对总黄酮的测定无影响。

表5 不同仪器测定结果Tab.5 Measurement results by different instruments

3 不同产地油麻血藤中总黄酮含量比较

精密称取凯里、兴义、荔波产油麻血藤各2份，各约0.25 g，照2.5项下方法操作，计算总黄酮量，并对得到的数据进行分析，结果见表6。由表6可知，贵州凯里油麻血藤中总黄酮含量为8.736%，贵州荔波油麻血藤中总黄酮含量为7.881%，贵州兴义油麻血藤中总黄酮含量为8.915%。

表6 含量测定结果Tab.6 Content determination results

4 结果

油麻血藤总黄酮以芦丁标准物质计，通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色，使黄酮紫外吸收红移，在510 nm 波长进行测定。这种方法可行性高，精确度非常理想，稳定性良好，满足样品加标回收试验，通过此方法能很好地测得不同产地的油麻血藤中总黄酮的含量，其中贵州兴义的油麻血藤总黄酮含量最高，为8.915%，贵州荔波的油麻血藤总黄酮含量最低，为7.881%。该方法可以用于贵州产油麻血藤质量控制和评价。