HPLC法同时测定冠心生脉丸中5种成分的研究

2022-09-05张文涛

黑龙江科学 2022年16期

葛蕾，郑辉，张文涛，赵锐

(淄博市食品药品检验研究院，山东淄博 255086)

0 引言

冠心生脉丸由中医古方“生脉饮”加味而成，是纯中药制剂，主要以人参、五味子、丹参、赤芍等组方，诸药合用可以益心气、活心血、通心络，对于冠心病、心绞痛、心律不齐等疾病具有良好的治疗作用[1]。五味子有敛汗生津的功效，其主要成分为五味子醇甲。丹参能化瘀止痛，活血通脉，有效成分主要是丹参素钠、丹参酮ⅡA和丹酚酸B。赤芍有活血化瘀、增强祛瘀止痛之功，主要是芍药苷发挥作用。故此，测定主要有效成分含量对控制产品质量至关重要，也是药品能发挥功效的重要依据。

现行质量标准中无含量测定项，通过查询文献发现，以往研究中，有对冠心生脉丸中芍药苷、丹参酮ⅡA和丹参素含量测定的报道[2-4]，但未查询到对五味子醇甲和丹酚酸B含量的测定文章，也未见丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷同时测定的方法研究。为了全面监控药品质量，使检验效率更高、结果更准确，使用HPLC-DAD法，建立了同时测定5种成分的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪Agilent 1260型，DAD检测器(美国安捷伦公司生产)。电子分析天平ML204型，感量0.1 mg；MS205DU型，感量0.01 mg(均为瑞士梅特勒-托利多公司生产)。高纯水仪IQ 7000型(美国密理博公司生产)。超声波清洗器KQ-300GVDV型(宁波科生仪器厂生产)。冠心生脉丸样品(批号分别为20210406、20210410、20210608)均为市售。芍药苷(批号110736-202145，含量94.6%)、五味子醇甲(批号110857-201815，含量99.7%)、丹参酮ⅡA(批号110766-202022，含量98.9%)、丹酚酸B(批号111562-201917含量96.6%)、丹参素钠(批号110855-201915 含量97.8%)(均为中国食品药品检定研究院生产)。甲醇、乙腈均为色谱级(美国默克生产)。磷酸优级(国药集团生产)。

1.2 溶液的配制

对照品单标溶液：精密称取芍药苷10.34 mg、五味子醇甲9.60 mg、丹参酮ⅡA10.55 mg、丹酚酸B44.16 mg和丹参素钠41.28 mg。准备25 mL量瓶，分别置于其中，溶解定容使用50%甲醇水溶液。

混标溶液：分别精准量取单标液适量，预备10 mL量瓶，全部放置其中，定容使用50%甲醇水溶液，得到丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷分别为100.92、8.35、5.74、117.31和29.34 μg/mL的混标溶液。

样品溶液：取样品5袋，捣碎研细，精密称取1 g置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声60 min，取出放凉，定容使用甲醇，用有机滤膜(0.45 μm)过滤即得。

阴性样品溶液：按药品制备方法制备缺丹参、赤芍、五味子的阴性样品，按样品溶液制备方法操作，即得。

1.3 色谱条件

色谱柱Agilent Eclipse Plus C18(5 μm；4.6×250 mm)。检测器为DAD检测器。流动相0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱0～2 min，流动相A92%，2～10 min，流动相A92%→75%，10～30 min，流动相A75%→10%，流速2.0 mL/min。柱温35℃，进样量20 μL。此色谱条件下，邻峰分离度均大于30，色谱峰的理论板数均大于5 000，阴性样品对检验结果无干扰。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

所测5种成分紫外最大吸收波长各不相同，如果采用单一波长会出现某种成分峰面积较小、测量不准确的情况。通过查阅相关文献[5-9]，在200～400 nm用DAD检测器进行全波长扫描，确定了5种成分紫外最大吸收波长。根据样品中5种化合物的含量，综合考量峰面积大小、检测精度、操作方便，计算简单等因素，确定在230 nm波长处测定丹酚酸B、芍药苷和五味子醇甲的含量，丹参素钠含量测定采用286 nm波长，丹参酮ⅡA含量的测定采用270 nm波长。

2.2 流动相和流速的选择

采用等度洗脱很难将4种成分与其他复杂成分分离开，因此建立一种梯度洗脱方法[10-12]。分别考察了乙腈和甲醇与水、0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液的多种组合，结果乙腈-0.1%磷酸为流动相效果最好，5种成分色谱峰峰形尖锐，分离度好。流速分别考察了1.0、1.5和2.0 mL/min 3种流速，经过多次试验，最终选择了2.0 mL/min流速，既可以保证分离效果同时大大缩短了时间，极大提高了工作效率。

2.3 提取方法的选择

考察了加热回流和超声波两种提取方法，测定结果无明显差别，故选择易操作的超声法。对超声提取时间(30、60和80 min)也做了考察，发现超声30 min结果偏小，超声60 min与80 min结果差别不明显，故提取时间定为60 min。

2.4 线性方程与检出限

分别吸取混标溶液5、10、20 、25、30 μL，按1.3色谱条件测试，以峰面积为纵坐标，标液浓度为横坐标，绘制方程。

将混标溶液溶液不断稀释，按1.3色谱条件测试，通过测量11次空白溶液浓度的标准偏差，从而得出检出限和定量限。5种组分的回归方程，检出限和定量限见表1。

2.5 精密度试验

取混合标液20 μL，按1.3色谱条件测定6次，丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷峰面积的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%、0.9%和1.2%(n=6)，表明仪器精密度良好。

表1 5种化合物线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Tab.1 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of 5 compounds

2.6 重复性试验

取相同样品6份，按1.2中的方法制备，按1.3中色谱条件进样20 μL，分别测定丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷的含量，结果平均含量分别为5.89、0.37、0.24、4.68和1.22 mg/g ，RSD分别为1.4%、1.4%、1.2、1.6和1.5%，说明本方法有较好的重复性。

2.7 稳定性试验

分别于0、2、4、8、12、24 h测定样品溶液，结果丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷峰面积的RSD分别为1.81%、1.43%、1.12%、1.29%和1.34%，说明样品溶液放置24 h具有良好的稳定性。

2.8 回收率试验

取同一批样品各1 g，置50 mL量瓶中，共6份，分别精密加入丹参素钠、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍药苷单标溶液3.5 mL、0.8 mL、0.6 mL、2.5 mL和3 mL，按1.2中方法制备，分别测定，得到加标回收率，结果见表2。由表2可知，平均回收率范围在99.18%～101.69%，说明此方法有良好的准确性。