超声波-微波协同萃取豆蔻明工艺研究

◎ 刘佳哲，吴小芝，路 畅，张东娜，姜晓坤

(吉林农业科技学院，吉林 吉林 132001）

草豆蔻为姜科山姜属植物草豆蔻的干燥近成熟种子，味辛、性温，具有去异增香的作用。草豆蔻一般作为食品香辛料添加剂，适用于香辛料和调味品的生产、流通、使用[1-2]。草豆蔻中含有的豆蔻明具有抗炎、抗菌、抗血小板聚集、抗氧化等多种生物活性[3-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

草豆蔻（市购，无腐烂变质）；动物血液（市购)；无水乙醇（天津市鼎盛鑫化工有限公司）；豆蔻明标准品（上海源叶生物科技有限公司）。

1.1.2 试验仪器

AL-2045电子天平（上海菁海仪器有限公司）；HH-4恒温水浴锅（国华电器有限公司）；SY-720超声波清洗机（昆山超声仪器公司）；BCD-221WDPT冰柜（青岛海尔股份有限公司）；DHL-820A恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；H2050R高速冷冻离心机（湖南湘仪试验室仪器开发有限公司）；UV-721PC紫外分光光度计（上海驰唐仪器设备有限公司）；微波炉。

1.2 豆蔻明提取的操作流程

①筛选草豆蔻、烘干。将购买的草豆蔻用清水洗净，去除杂质，放入65 ℃干燥箱内烘干。②粉碎、过筛。将烘干的的草豆蔻放入粉碎机中粉碎，过筛。③称重。称取草豆蔻粉末20 g。④超声波-微波辅助提取。设置超声波功率600 W，超声波时间12 min，微波功率600 W，微波时间80 s。⑤过滤。将提取液用滤纸过滤。⑥浓缩。将滤液放入蒸发皿用水浴锅将滤液浓缩。⑦纯化。利用大孔吸附树脂的特性将浓缩物进行纯化。⑧干燥。将纯化后的待测物进行浓缩干燥。⑨将0.01 g粗制豆蔻明溶于80%的乙醇溶液中制成标准溶液，按照标准曲线制备方法测定吸光度，带入标准曲线，计算出豆蔻明的浓度。

1.3 标准溶液的配制

精确称取0.01 g豆蔻明标准品制成0.1 mg·mL-1的豆蔻明标准溶液，分别吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL于试管中，用蒸馏水补至2 mL，摇匀后在波长346 nm处测定吸光度值，横坐标为豆蔻明浓度，纵坐标为吸光度值，得到标准曲线。

取纯化前样品溶液5 mL稀释1倍后，在波长 346 nm处测定吸光值，将测得的吸光度带入标准曲线中，获得豆蔻明浓度。

1.4 豆蔻明含量计算

豆蔻明含量（mg·g-1）计算公式为

式中：c为样品中豆蔻明浓度，mg·mL-1；f为稀释倍数；V为待测样溶液体积，mL；m为草豆蔻粉末的质量，g。

1.5 单因素试验

（1）不同乙醇体积分数对豆蔻明含量的影响。固定超声波功率600 W、超声波时间10 min、微波功率200 W、微波时间60 s，考察乙醇体积分数（20%、40%、60%、80%和100%）对豆蔻明含量的影响。

（2）不同超声波功率对豆蔻明含量的影响。固定乙醇体积分数80%、超声波时间10 min、微波功率200 W、微波时间60 s，考察超声功率400 W、500 W、600 W、700 W和800 W对豆蔻明含量的影响。

（3）不同超声时间对豆蔻明含量的影响。固定乙醇体积分数80%、超声波功率600 W、微波功率240 W、微波时间60 s，考察超声时间6 min、8 min、10 min、12 min和14 min对豆蔻明含量的影响。

（4）不同微波功率对豆蔻明含量的影响。固定乙醇体积分数80%、超声波功率600 W、超声波时间12 min和微波时间60 s，考察微波功率分别为300 W、400 W、500 W、600 W和700 W对豆蔻明含量的影响。

（5）不同微波时间对豆蔻明含量的影响。固定乙醇体积分数80%、超声波功率600 W、超声波时间12 min和微波功率600 W，考察微波时间20 s、40 s、60 s、80 s和100 s对豆蔻明含量的影响。

1.6 豆蔻明的定性分析

分别移取3.0 mL 0.1 mol•L-1的豆蔻明标准乙醇溶液和提取出的溶液于两只比色管中，在268 nm到 465 nm间扫描得到紫外吸收光谱，扫描对照两者的吸收光谱。

1.7 响应面试验

根据单因素试验结果，选择3个对豆蔻明含量影响最大的因素做响应面试验，确定最优的豆蔻明提取条件。

1.8 豆蔻明与抗血小板聚集活性的研究

取动物血浆，用质量分数为3.8%枸橼酸钠抗凝，在800 r·min-1下离心10 min，制备富血小板血浆。分别在测定管中加入265 μL 富血小板血浆，分别加入豆蔻明和阿司匹林至溶液终浓度分别为0.1 mmol·L-1，温孵5 min，加入5 μL二磷酸腺苷，用质量分数为1%的二甲基亚砜作空白，观察记录5 min内最大聚集率，计算豆蔻明和阿司匹林对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集的抑制率，计算公式为

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

将1.3中的系列标准溶液在波长346 nm处测定吸光度值，横坐标为豆蔻明浓度，纵坐标为吸光度值，得到标准曲线，见图1。由图1可知，y=88.757x+0.0293，R2=0.9997，线性关系良好。

图1 豆蔻明的标准曲线图

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 不同乙醇体积分数对提取液中豆蔻明含量 的影响

由图2可知，豆蔻明的含量随着乙醇体积分数的增加而增加，在乙醇体积分数为80%时达到最高值，然后逐渐降低，通过分析，选择乙醇体积分数为60%、80%、100%进行响应面试验。

图2 乙醇体积分数对提取液中豆蔻明含量的影响图

2.2.2 不同超声波功率对豆蔻明含量的影响

由图3可知，随着超声波功率的升高，提取液中豆蔻明含量逐渐增加，当超声波功率达到600 W时，豆蔻明提取率达到最高；超过600 W后，随着超声波功率的升高，豆蔻明的提取率逐渐降低。由此选择超声波功率600 W较好，并选择500 W、600 W、700 W进行响应面试验。

图3 超声波功率对提取液中豆蔻明含量的影响图

2.2.3 不同超声波时间对提取液中豆蔻明含量的影响

由图4可知，随着超声波时间的延长，豆蔻明含量逐渐增加，当达到8 min时，豆蔻明提取率达到最高，超过8 min后，随着时间的延长豆蔻明的提取率逐渐降低。因此，超声波时间选择8 min。

图4 超声波时间对提取液中豆蔻明含量的影响图

2.2.4 不同微波功率对提取液中豆蔻明含量的影响

由图5可知，随着微波功率的升高，豆蔻明的含量逐渐增加，当微波功率达到600 W时，豆蔻明含量达到最高，超过600 W后微波功率升高，豆蔻明含量逐渐降低。由此选择微波功率600 W较好，并选择500 W、600 W、700 W进行响应面试验。

图5 微波功率对提取液中豆蔻明含量的影响图

2.2.5 不同微波时间对提取液中豆蔻明含量的影响

由图6可知，随着微波时间的延长，豆蔻明含量逐渐增加，当达到80 s时，豆蔻明含量达到最高，超过80 s后，随着时间的延长，豆蔻明的含量逐渐降低。因此，微波时间选择80 s。

图6 微波时间对豆蔻明含量的影响图

2.3 豆蔻明的定性分析

分别移取3.0 mL 0.1 moL·L-1的豆蔻明标准品、乙醇溶液和样品提取液于两支比色管中，在268 nm到 465 nm间扫描得到紫外吸收光谱，扫描对照两者的吸收光谱。由图7、图8可知，待测样的扫描光谱与豆蔻明标准品的扫描光谱中，主要波峰基本吻合，可证明待测样中含有豆蔻明。

图7 豆蔻明标准品扫描光谱图

图8 待测样品扫描光谱图

2.4 响应面试验

根据单因素试验结果，选择微波功率、超声波功率、乙醇体积分数这3个对豆蔻名含量影响最大的因素做响应面试验，确定最优的豆蔻明提取条件，响应面试验因素水平见表1。利用Box-Behnken试验设计，确定3因素3水平共17组试验，试验设计及结果见 表2，以吸光度为响应值做响应面试验。由表3可知，模型P值＜0.0001，失拟项P值=0.0894，说明该模型拟合程度较好。AC、A2、B2、C2均达到极显著 水平。

表2 响应面试验结果表

表3 Box-Behnken Design分析试验数据表

由Box-Behnken回归分析，得到多元二次响应面回归模型为Y=2.54+0.060A-0.029B-0.073C-0.012AB-0.21AC-0.014BC-0.65A2-0.83B2-0.68C2，其决定系数R2=0.9990，说明回归方程拟合度很好，98%的吸光度值与各因素变量之间关系可以用此模型解释，且调整决定系数R2adj=0.9977与R2接近，表明实测值和模型预测值具有较好的相关性。预测决定系数R2pred=0.9863，表明该模型可以预测98.63%的吸光度值与各因素变量之间关系。根据二次回归方程预测求极值得：当乙醇提取分数为81.116%、超声波功率为598.225 W、微波功率为593.842 W时，吸光度有最大值为2.548。结合操作可行性，将工艺条件调整为乙醇体积分数80%，超声波功率600 W，微波功率 600 W。对最佳试验条件进行验证，豆蔻明提取液吸光度为2.542，与理论值相比，误差为0.1%，响应面法优化结果准确、可靠。各因素对吸光度影响的响应面和等高线图见图9。

图9 各因素对吸光度影响的响应面和等高线图

2.5 豆蔻明与抗血小板聚集活性的研究

由表4知，豆蔻明对于抑制血浆中的血小板的聚集有一定的效果，但是效果不如阿司匹林。

表4 不同时间下血浆中加入药品后的透射比表

3 结论

本文是关于超声微波协同萃取草豆蔻中豆蔻明及其与血小板聚集活性的研究。利用超声波和微波的空化作用对豆蔻明进行提取并以此为原料进行豆蔻明与抗血小板聚集活性相互作用的研究，操作技术简单，提取效率高，能大大缩短提取时间。通过定性试验的结果可以得出，试验所萃取的提取液中确实含有豆蔻明。响应面试验结果表明，对于草豆蔻中的豆蔻明的最佳萃取条件为乙醇分数80%，超声波功率600 W，超声波时间8 min，微波功率600 W，微波时间80 s。由豆蔻明与抗血小板聚集活性研究试验可以得出，豆蔻明对血小板聚集有部分抑制效果。