2个品种山羊瘤胃菌群结构比较及其功能预测分析

2022-09-05张叁保申玉建高小童韦英明蒋钦杨

南方农业学报 2022年6期

张瑜，张叁保，申玉建，胡艳，高小童，韦英明，蒋钦杨*

（1广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2广西大学农牧产业发展研究院，广西南宁 530004）

0 引言

【研究意义】瘤胃作为反刍动物特有的消化器官，栖息着大量微生物群，类似于一个大型的厌氧发酵罐，是反刍动物消化日粮的重要场所（邓波波等，2020；周俊华等，2021）。在瘤胃微生物的协同作用下，将饲料降解为可吸收利用的小分子营养物质，可为动物机体提供65%～75%的能量需求。已有研究表明，环境因素（季节、日粮结构和地方）与遗传因素（动物品种和年龄）等均会对瘤胃菌群产生影响（徐琴，2015）。瘤胃微生物区系与宿主存在互利共生的双向关系，微生物组成结构与功能的改变会直接影响宿主的功能及其表型，且瘤胃微生物与反刍动物的生长发育及其生产效率紧密相关（Jewell et al.，2015；Shabat et al.，2016）。因此，开展山羊瘤胃微生物菌群特征及品种间瘤胃微生物差异研究，对阐述山羊的适应性及品种间不同的生长性能具有重要意义。【前人研究进展】高通量测序技术的出现与快速发展为胃肠道微生态的研究提供了新方向，能更准确地鉴定微生物类群，为系统开展微生物多样性分析和系统进化研究奠定了基础（Ercolini et al.，2012；张洁等，2019）。16S rDNA序列存在于所有细菌染色体的基因组中，因其具有高度的特异性和保守性，已广泛应用于细菌系统分类与鉴定（Lei and Zhang，2014）。近年来，基于菌群16S rDNA测序技术开展奶牛（Fang et al.，2015）、山羊（Langda et al.，2020）、绵羊（Li et al.，2020）和骆驼（Rabee et al.，2020）等反刍动物瘤胃微生物区系特征的研究已有进行大量报道，为深入了解不同反刍动物的瘤胃微生物区系特征奠定了基础。吴琼等（2020）基于16S rRNA序列的高通量测序和功能预测全面揭示了草原红牛、中国西门塔尔牛和安格斯牛瘤胃菌群的多样性及功能。Langda等（2020）基于16S rDNA测序技术对高海拔地区藏山羊和绵羊2个物种间的瘤胃微生物多样性进行分析，结果表明反刍动物的环境适应性与瘤胃中的微生物高度相关。Yang等（2020）使用高通量测序技术比较大小尾寒羊不同胃肠段的肠道菌群结构，结果发现2个品种差异菌群的代谢过程可能影响绵羊脂肪型大尾表型的形成。此外，Huang等（2017）、Chang等（2020）基于16S rDNA测序技术先后分析放牧在青藏高原上的典型高原绵羊（西藏绵羊和甘肃高山细毛绵羊）和4个不同绵羊品种的肠道细菌群落。可见，品种也会影响机体胃肠道微生物区系特征，但目前研究对象多为绵羊和牛等反刍动物，有关山羊品种差异对其瘤胃微生物组成的影响尚无研究报道。【本研究切入点】山羊作为适应能力极强的家养反刍动物，其瘤胃微生物特征及品种间瘤胃微生物菌群差异研究对阐述山羊较强的环境适应性和较高的生产性能具有重要意义。努比亚山羊作为引进品种，是世界上著名的乳肉兼用型品种，能很好地适应广西的生态环境，并表现出自身繁殖能力强、生长速度快的优势；都安山羊作为广西的地方肉用山羊品种，虽具有抗逆性强、耐粗饲的特点，但其繁殖能力和生长性能与努比亚山羊相比相差甚远（曹艳红等，2020）。因此，探究这2个山羊品种的瘤胃微生物特征及其品种间差异，对丰富现有胃肠道微生物研究及阐述瘤胃微生物对山羊适应性的影响具有重要意义。【拟解决的关键问题】采用16S rDNA扩增子高通量测序技术对都安山羊和努比亚山羊的瘤胃微生物特征进行分析，旨在阐明山羊瘤胃微生物特征及品种间的差异，为进一步研究不同山羊品种生长性能与瘤胃微生物群间的关系提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

随机挑选体况良好且年龄相近（3～4岁）的都安山羊（母羊，平均体重36.07±1.06 kg）和努比亚山羊（母羊，平均体重50.93±0.63 kg）各3只，饲养于广西大学动物科学技术学院实验基地。每天8：30和17：30饲喂2次，确保山羊自由采食、自由饮水，试验日粮配方及其营养水见表1。试验山羊正常饲喂6个月后，停食24 h、停水2 h屠宰，采集经4层纱布过滤的瘤胃液2 mL，迅速置于液氮中保存备用。

1.2 瘤胃细菌DNA提取与测序

参照PowerSoilDNA Isolation Kit试剂盒说明提取样品微生物DNA。微生物16S rDNA序列通用引物为27F（5'-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'）。PCR反应体系20.0 μL：2×KOD Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，KOD聚合酶0.4 μL，DNA模板50 ng，ddHO补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃2 min，进行25个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送至百迈客生物科技有限公司测序。

1.3 生物信息学处理

根据SMRT Link（v8.0）对原始序列（Raw reads）进行校正得到CCS（Circular consensus sequencing）序列，然后使用Lima（v1.7.0）根据barcode识别样品的CCS序列并去除嵌合体（Uchime，v8.1），即得到高质量的CCS序列。按照相似度大于97%的原则用Uparse（USEARCH，v10.0）将序列聚类为分类操作单元（Operational taxonomic unit，OTU），使用RDP Classifier 2.2与SILVA分类学数据库进行物种注释，得到OTU分类学信息，并以PICRUSt2进行KEGG微生物群落功能预测。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2016进行整理，组间Alpha多样性采用Mothur v1.30进行分析；利用Metastats对组间的菌群丰度差异进行显著性检验，在门和属分类水平上分析品种间的物种差异；同时应用Binary-Jaccard在OTU水平上对所有样品进行主坐标分析（Principle coordination analysis，PCoA）、相似分析（Analysis of similarity，ANOSIM）及Beta多样性分析。

2 结果与分析

2.1 测序分析结果

6份山羊瘤胃液样本共测序获得49804条Raw reads，经质控和去嵌合体等处理后得到有效CCS序列42060条（表2），平均每个样品7010条。其中，都安山羊瘤胃液样本的Raw reads为21936条，有效CCS序列为18155条，优化比例为82.76%，序列长度为1448.3 bp，OTU数目为903个；努比亚山羊瘤胃液样本的Raw reads为27868条，有效CCS序列为23905条，优化比例为85.78%，序列长度为1454.3 bp，OTU数目为1381个。由图1可看出，山羊瘤胃液样本Shannon指数的稀释曲线（图1-A）呈缓和趋势，说明测序深度趋于饱和，足以代表瘤胃液中的物种丰富度。有效CCS序列在按相似度大于97%的原则进行聚类，共获得2284个OTUs，其中有502个OTUs为都安山羊和努比亚山羊所共有（图1-B）。

2.2 山羊瘤胃微生物群落结构分析结果

以SILVA为参考数据库，使用朴素贝叶斯分类器（Naive-Bayes classifier）结合比对的方法对特征序列进行分类学注释，以获知每个特征对应的物种分类信息，进而在门和属分类水平上统计各样品群落组成。由图2-A可知，2个山羊品种瘤胃微生物在门分类水平上的组成相似，均以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌群，在都安山羊样本中的对应相对丰度分别为58.32%、29.41%和4.26%，在努比亚山羊样本中的对应相对丰度分别为45.66%、38.69%和6.59%。由图2-B可知，在属分类水平上则以奎因氏菌属（）、普氏菌属-1（_1）和理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）为优势菌群，在都安山羊样本中的对应相对丰度分别为36.93%、9.67%和12.07%，在努比亚山羊样本中的对应相对丰度分别为12.91%、13.92%和11.47%。

2.3 山羊瘤胃微生物群落Alpha多样性分析结果

由表3可知，都安山羊和努比亚山羊瘤胃微生物群落的各项Alpha多样性指数均无显著差异（＞0.05，下同），说明2个品种间的瘤胃微生物多样性差异不显著。

2.4 山羊瘤胃微生物群落Beta多样性分析结果

应用Binary-Jaccard在OTU水平上对所有山羊瘤胃液样本进行PCoA分析，结果（图3-A）显示2个山羊品种的瘤胃液样本聚类不明显，即都安山羊和努比亚山羊的瘤胃微生物区系差异不明显。ANOSIM分析结果也表明都安山羊和努比亚山羊的瘤胃微生物组成差异不明显（图3-B）。

2.5 山羊品种间瘤胃差异菌种分析结果

为明确不同山羊品种间的瘤胃微生物群落丰度差异，利用Metastats对组间的物种丰度进行检验，结果表明，在门分类水平（表4）上2个山羊品种间存在明显差异，其中，都安山羊瘤胃中不可培养菌_k_细菌（Uncultured_bacterium_k_bacteria）的相对丰度极显著低于努比亚山羊（＜0.01，下同），黏胶球形菌门（Lentisphaerae）的相对丰度则显著低于努比亚山羊（＜0.05，下同）。在属分类水平（表5）上，都安山羊瘤胃中奎因氏菌属的相对丰度极显著高于努比亚山羊，不可培养菌_k_细菌（Uncultured_bacterium_k_Bacteria）的相对丰度极显著低于努比亚山羊，而、疣微菌科_UCG-010（Ruminococcaceae_UCG-010）、Probable_genus_10、不可培养菌_f_p-251-o5（Uncultured_bacterium_f_p-251-o5）、不可培养菌_f_vadinBE97（Uncultured_bacterium_f_vadinBE97）、不可培养菌_o_拟杆菌（Uncultured_bacterium_o_Bacteroidales）、疣微菌科_UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）、、脱硫弧菌属（）、丁酸弧菌属（）及的相对丰度显著低于努比亚山羊。

2.6 山羊瘤胃微生物群落功能预测结果

使用PICRUSt2对山羊瘤胃微生物群落功能进行预测，结果（表6）显示，在相对丰度大于0.1%的山羊瘤胃微生物群落功能中，努比亚山羊的γ-氨基丁酸能突触（GABAergic synapse）、谷氨酸能突触（Glutamatergic synapse）和丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）极显著高于都安山羊；而都安山羊的碳水化合物消化吸收（Carbohydrate digestion and absorption）和β-丙氨酸代谢（beta-Alanine metabolism）极显著高于努比亚山羊。都安山羊的C5支链二元酸代谢（C5-Branched dibasic acid metabolism）、甘油脂类代谢（Glycerolipid metabolism）、硝基甲苯降解（Nitrotoluene degradation）、RNA运输（RNA transport）、萜类骨架生物合成（Terpenoid backbone biosynthesis）、II型糖尿病（Type II diabetes mellitus）、泛醌及其他萜类醌生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）等7个微生物群落功能的相对丰度显著高于努比亚山羊。这些功能主要涉及萜类化合物和聚酮类化合物代谢（Metabolism of terpenoid and polyketides）、外源性物质生物降解与代谢（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、脂质代谢（Lipid metabolism）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、运输和分解代谢（Transport and catabolism）、辅酶因子和维生素代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、其他次要代谢物生物合成（Biosynthesis of other secondary metabolites）、其他氨基酸代谢（Metabolism of other amino acids）、细胞生长和死亡（Cell growth and Death）、转录（Transcription）、翻译（Translation）、消化系统（Digestive system）、信号转导（Signal transduction）、神经系统（Nervous system）、内分泌代谢疾病（Endocrine and metabolic disease）、药物抵抗（杀菌剂）［Drug resistance（Antimicrobial）］和神经变性疾病（Neurodegenerative disease）等。

3 讨论

3.1 山羊瘤胃微生物区系特征

瘤胃微生物在反刍动物的营养和健康中扮演着重要角色，分析不同品种对瘤胃微生物群落的影响具有重要生物学意义。本研究结果表明，都安山羊和努比亚山羊在门分类水平上的瘤胃微生物组成相似，其中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是优势菌群，与Langda等（2020）的研究结论基本一致。牧草作为反刍动物的主要饲料，包含纤维素、半纤维素和木质素。厚壁菌门包含许多纤维分解细菌（Hook et al.，2011），拟杆菌门是肠道中非纤维状植物成分的主要降解剂（Hess et al.，2011），且具有降解植物多糖的能力（Pope et al.，2012），因此二者可协助宿主消化吸收碳水化合物、蛋白及代谢纤维等（Huo et al.，2014）。变形菌门积极参与生物膜形成、饲粮发酵及可溶性碳水化合物的消化等过程（Pitta et al.，2016），极大地提高山羊的消化吸收效率。在属分类水平上，奎因氏菌属、普氏菌属-1和理研菌科RC9肠道群是优势菌群。其中，普氏菌属-1隶属于拟杆菌门，是反刍动物瘤胃中最具优势的菌属（Bekele et al.，2010；Jami and Mizrahi，2012），占瘤胃微生物群落的60%～70%，包含高活性的半纤维素分解微生物，有利于分解植物中非纤维状多糖或蛋白（Kim et al.，2011），为宿主提供了从纤维植物中消化和摄取营养的能力（Schnorr et al.，2014）。普氏菌属不仅影响木聚糖酶和羧甲基纤维素酶降解木质纤维素的过程，还参与蛋白、淀粉和半纤维素等的代谢及挥发性脂肪酸的产生（Nyonyo et al.，2014）。Li等（2015）研究发现普氏菌属对梅花鹿瘤胃中饲料的发酵过程有显著影响。本研究通过比较都安山羊和努比亚山羊瘤胃菌群组成，发现努比亚山羊的瘤胃菌群多样性更高，隶属于厚壁菌门的菌群相对丰度也更高，由于厚壁菌门与动物机体的体重增加呈正相关（Borgo et al.，2017），可能是努比亚山羊较都安山羊生长速度更快的主要原因。

3.2 品种对山羊瘤胃微生物组成的影响

本研究中，山羊品种间瘤胃微生物相对丰度差异最明显的菌门是不可培养菌_k_细菌和黏胶球形菌门，差异最明显的菌属是奎因氏菌属。努比亚山羊的拟杆菌门和普氏菌属相对丰度均高于都安山羊，可能与其具有较强的环境适应能力相关。Shen等（2016）研究发现，疣微菌门（Verrucomicrobia）相对丰度随饲粮中非纤维碳水化合物含量的增加而显著升高。在本研究中，都安山羊瘤胃中疣微菌科UCG-010和疣微菌科UCG-002的相对丰度显著低于努比亚山羊，表明努比亚山羊在消化吸收富含非纤维碳水化合物方面更具优势。此外，丰富多样的胃肠道微生物群落积极参与调控肌肉的生长发育（吴敏等，2019）和脂肪沉积（杨华，2018）。该结论在本研究中得到进一步验证，即具有丰富微生物群落的努比亚山羊表现出更高的生长性能，可能也是具有较强适应性的主要原因。

品种是影响胃肠道微生物的重要因素，对瘤胃细菌群落组成的影响大于饲粮或其他因素（刘开朗等，2009）。Huang等（2017）通过比较西藏绵羊和甘肃高山细毛绵羊的瘤胃细菌群落组成及其多样性，发现2个品种间很少有重叠的已知细菌，西藏绵羊的瘤胃细菌多样性更高可能使其适应恶劣高原环境的能力更强。Bohra等（2019）研究表明，家牛和水牛的瘤胃菌群结构因品种和喂养方式的不同而存在明显差异。Xin等（2019）研究证实奶牛和黄牛的微生物群与生活在不同海拔高度牦牛群的微生物群存在显著差异。Chang等（2020）研究发现，藏绵羊的肠道细菌群落相对丰度及品种多样性显著低于多塞特绵羊、杜泊绵羊和小尾寒羊，表明绵羊品种会影响其肠道细菌群落。Yang等（2020）通过比较小尾寒羊和大尾寒羊胃肠道微生物的组成和分布，发现不同胃肠道段定殖不同微生物群落，且2个品种差异菌群［毛螺菌科（Lachnospiraceae）和阿克曼氏菌属（）］的代谢过程可能影响其脂肪型大尾表型的形成。可见，宿主是胃肠道微生物多样性的重要影响因素。在本研究中，可能是由于样本数量的局限，以及受采食偏好和运动情况（Batacan et al.，2017）等个体差异因素的干扰，导致都安山羊和努比亚山羊间的瘤胃微生物群落差异不显著。

3.3 品种对山羊瘤胃微生物功能的影响

以高通量测序技术与反刍动物基因组相结合对微生物进行建库，同时将其结构和功能与宿主连接可有效推动微生物领域的快速发展（Morgavi et al.，2013）。本研究结果表明，努比亚山羊的γ-氨基丁酸能突触、谷氨酸能突触和丙酮酸代谢等预测功能的相对丰度极显著高于都安山羊，而都安山羊的碳水化合物消化吸收和β-丙氨酸代谢等预测功能的相对丰度极显著高于努比亚山羊。说明都安山羊和努比亚山羊的瘤胃微生物在碳水化合物代谢及其他氨基酸代谢和神经系统等功能存在显著差异。

本研究通过16S rDNA序列分析山羊瘤胃微生物群落结构，揭示了与品种相关的复杂细菌群落，有助于识别都安山羊和努比亚山羊的瘤胃菌群结构，为进一步研究山羊品种及性能与瘤胃微生物群的关系提供了理论依据。但由于本研究尚未开展更多品种的山羊瘤胃微生物组成分析，且样本数量较少，得出的结果具有一定局限性，难以全面阐释菌群差异形成的原因。因此，今后需扩大试验群体深入探究山羊瘤胃微生物的影响因素及其与生长性能和繁殖性能的关联性。