F3代波杂山羊XKR4基因多态性与生长性状的关联分析

2022-09-05田贵刚安冬伟邹启顺

南方农业学报 2022年6期

阮涌，陈祥，田贵刚，安冬伟，邹启顺

（1高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2铜仁市万山区动物疾病预防控制中心，贵州铜仁 554200；3务川自治县宏牧羊业有限公司，贵州遵义 564300）

0 引言

【研究意义】贵州白山羊是我国肉用型优良地方山羊品种之一，具有性成熟早、繁殖力高、适应性强、板皮质优等特性（杨家大等，2016；张黔浪等，2016；王鑫等，2017），但也存在体型小、屠宰率低及生长速度慢等缺点（安清明等，2020）。为改善贵州白山羊生长性能，通过引进波尔山羊为父本杂交获得F代，选择其优秀个体为母本，以贵州白山羊为父本杂交获得F代，再以贵州白山羊为父本杂交形成F代。因此，分析F代波杂山羊生长性能与生长性状相关基因多态性的关联性，可为后期培育出既改善贵州白山羊生长缓慢及体型小的缺点，又保留贵州白山羊优良肉品质的新品系提供科学数据，进而加快贵州白山羊新品系的育成。【前人研究进展】至今，有关山羊生长性能与生长性状相关基因多态性的关联分析已有较多研究报道（Nguyen et al.，2011；王玺年等，2013；姚毅等，2015a，2015b）。康建兵（2016）研究证实，瘦素基因（）G14651A位点与贵州白山羊成年羊的体重显著相关，且GA基因型个体显著高于GG基因型个体，管围方面则是GA基因型和AA基因型个体显著高于GG基因型个体；瘦素受体基因（）A71354G位点与贵州白山羊周岁羊胸围显著相关，且GG基因型个体的胸围显著高于AA基因型个体。田应志等（2017）在贵州白山羊生长性状与肝脏型脂肪酸结合蛋白基因（）相关性的研究中发现，C4557T和A4575G位点多态座位有利于提高贵州白山羊体重、体高、体斜长和管围，其中CCGG基因型有利于提高贵州白山羊成年母羊的体高和体斜长，TTGG基因型有利于提高贵州白山羊周岁母羊的体重和管围。熊琪等（2017）在分析山羊肌醇磷酸酶基因（）与生长性状的关联性时发现，基因内含子2存在1个U/A突变的SNP位点，且该位点与初生重量、胸围、管围和体高等性状显著相关，等位基因C与生长呈正相关。Li等（2020）在研究基因拷贝变异数与山羊生长性状的相关性时发现，基因拷贝数与贵州白山羊的生长性状显著相关。Shi等（2020）研究发现，山羊基因拷贝数变异对其体重、体长和体高的影响存在显著相关，因此基因拷贝数可作为辅助山羊生长性状选择的分子标记。Xu 等（2020）通过研究基因与中国山羊群体生长性状的相关性，发现贵州白山羊270型缺失个体的胸围优于正常个体。【本研究切入点】基因是Kell血型系统相关亚单元家族（XKR）成员之一，在生物体内参与红细胞膜功能、神经系统发育、细胞代谢、脂肪代谢及糖类代谢，并调控动物的生长和发育过程（Russo et al.，1998；吴周林，2015；赵克慧，2015），目前已有研究发现基因是兔生长性状相关基因，可作为兔品种选育的重要分子标记（吴周林等，2016）。山羊作为重要的草食动物，与兔具有相同的食性，因此明确基因多态性与山羊生长性状的相关性对指导生产具有重要意义。【拟解决的关键问题】以F代波杂山羊为研究对象，通过血液DNA混池测序的方法对基因SNP位点进行鉴定，并与F代波杂山羊的生长性状进行关联分析，旨在筛选出优异基因为后期培育新品系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

F代波杂山羊由务川县宏牧羊业有限公司提供，选取统一饲养环境下的107只F代波杂山羊，通过颈静脉采集5 mL血液置于EDTA抗凝管中。测量并记录F代波杂山羊初生、6月龄和12月龄的体重、体高、体长、胸围及管围等生长数据。

1.2 试验试剂及仪器设备

DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，2×PCR StarMix购自西宝生物科技（上海）股份有限公司，DM 2000 DNA Marker购自北京擎科生物技术有限公司。超微量分光光度计（Thermo Mano Drop 2000）和高速冷冻离心机（RC-6 Plus）购自美国Thermo公司，梯度PCR仪（9902）购自德国ABI公司，凝胶成像系统（Universal Hood II）购自美国Bio-Rad公司。

1.3 引物设计与合成

NCBI已公布的山羊基因（NC030821.1）全长313040 bp，包含3个外显子区域。根据引物设计优化原则，采用Primer Premier 5.0设计覆盖外显子区域的PCR扩增引物（表1），委托北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 F3代波杂山羊DNA提取及检测

利用血液DNA提取试剂盒提取血液DNA，采用超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-20 ℃保存备用。

1.5 PCR扩增及测序

PCR 反应体系40.0 μL：2×PCR StarMix 20.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddHO 15.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，55～65 ℃1 min，72 ℃30 s，进行32个循环；72 ℃终延伸7 min。PCR扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进检测。同时，对提取的107头羊血液DNA混池（1.5 μL）进行PCR扩增，PCR扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，用DNAStar对测序结果与原始序列进行对比，筛选出SNP位点。

1.6 数据处理

采用Excel 2017计算SNP位点的等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度（）、期望杂合度（）、有效等位基因数（）及多态信息含量（PIC）等，以卡方（χ）检验分析基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡状态（周春宝等，2021），并利用SPSS 25.0分析不同基因型与生长性状的关联性。

2 结果与分析

2.1 SNP位点检测结果

利用表1中的引物与DNA混池进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（图1）后送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果表明，F代波杂山羊基因Exon-2扩增区域存在2个SNPs位点（图2），分别是C194069A和T194091A，均属于Intron-1区域。

2.2 F3代波杂山羊XKR4基因SNPs位点遗传学分析结果

由表2可知，F代波杂山羊基因2个SNPs位点的PIC均处于中度多态水平。C194069A位点的等位基因频率中C＞A，优势基因型为CC型；T194091A位点的等位基因频率中T＞A，优势基因型为TT型。χ检验结果表明，C194069A和T194091A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（＞0.05）。

2.3 F3代波杂山羊XKR4基因SNP位点不同基因型与生长性状的关联性

运用SPSS 25.0对F代波杂山羊C194069A和T194091A位点各基因型在初生、3月龄、6月龄和12月龄时的体重、体高、体斜长、胸围及管围进行差异性分析。结果显示：在初生（表3）群体中，T194091A位点AA基因型与其他基因型的体斜长存在显著差异（＜0.05，下同）。在3月龄（表4）群体中，C194069A和T194091A位点各基因型的生长性状指标间均无显著差异（＞0.05，下同）。在6月龄（表5）群体中，C194069A和T194091A位点AA基因型的体重分别与相应位点的CC基因型和TT基因型存在显著差异。在12月龄（表6）群体中，C194069A位点AA基因型在体重和胸围方面均极显著优于CC基因型（＜0.01，下同），在体高方面与CC基因型存在显著差异；T194091A位点AA基因型的体重、体斜长分别与TT基因型呈显著或极显著差异。对不同时段的日增重进行分析，结果（表7）发现在0～6月龄和0～12月龄，C194069A和T194091A位点AA基因型的日增重与相应位点的CC基因型和TT基因型分别存在呈显著或极显著差异。综上所述，基因C194069A位点AA基因型个体的生长性能优于CC基因型个体和CA基因型个体，T194091A位点AA基因型个体的生长性能也优于TT基因型个体。

3 讨论

目前，与山羊生长性状相关的基因已有较多研究报道。如基因与贵州白山羊的体重增长相关，且AB基因型在生长性状上优于AA基因型和BB基因型（Cai et al.，2013）；基因多态性与贵州黑山羊的体重和体尺性状相关（罗开鹏等，2014）；贵州本地山羊基因G127A突变位点的GA基因型在体斜长、胸围和管围方面显著高于GG基因型和AA基因型（谢海强等，2014）。基因在生物体内广泛参与细胞代谢、脂肪代谢及糖类代谢，进而调控机体的生长发育过程（吴周林，2015）。本研究的Hardy-Weinberg平衡检验结果表明，F代波杂山羊基因C194069A和T194091A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，其PIC处于中度多态性（0.25＜PIC＜0.50），可进行生长性状的关联分析，在山羊育种工作中有一定参考价值。

关于基因在畜禽育种中的应用已有相关研究报道。澳大利亚牛的肉和胴体性状全基因组关联性研究发现基因SNP位点与牛皮下脂肪厚度相关（Bolormaa et al.，2011）；在籼牛和杂交牛的研究中发现，基因SNP位点（rs41724387）表达与臀部脂肪厚度极显著相关（Porto Neto et al.，2012）；基因与内洛尔牛的初生重和成年体重相关（Utsunomiya et al.，2013）；基因多态性与羊茅饲养肉牛的血清催乳素浓度显著相关，推测基因在介导羊茅中毒的负面影响中发挥作用（Bastin et al.，2014）。此外，Lindholm等（2012）在研究基因上包含位置候选基因、和区域与牛采食和生长表型的相关性时发现，基因与牛群体的采食量和增重密切相关。可见，基因在动物脂肪沉积及肌肉生长等方面发挥重要作用，但至今鲜见与羊生产性能相关的研究报道。本研究通过直接测序发现在F代波杂山羊基因Intron-1区域存在2个SNPs位点，在6月龄和12月龄的F代波杂山羊群体中，C194069A位点的AA基因型与CC基因型在体重方面存在显著或极显著差异；T194091A位点AA基因型在初生群体中与TT基因型和TA基因型的体斜长存在显著差异，在6月龄和12月龄群体中，AA基因型与TT基因型的体重存在显著差异。此外，通过日增重分析发现这2个SNPs位点的AA基因型均优于其他基因型，提示基因C194069A和T194091A位点可应用于F代波杂山羊的后续育种工作。由于生长性状受遗传、性别和环境等因素的影响，因此今后可筛选更多基因进一步验证，从而培育出F代波杂山羊优势基因群体。