不同采烤方式对烤烟上部叶脂质褐变的影响

2022-09-05孙皓月贾宏昉谢良文冯长春伍德洋秦艳青陈汉发郭仕平

南方农业学报 2022年6期

孙皓月，贾宏昉，谢良文，冯长春，伍德洋，秦艳青，陈汉发，郭仕平*

（1河南农业大学烟草学院，河南郑州 450000；2四川省烟草公司，四川成都 610000；3四川省烟草公司凉山州公司，四川西昌 615000）

0 引言

【研究意义】烤烟上部叶因组织结构密而厚、生长过程中优越的田间光照通风条件导致物质积累较多，烘烤过程中常面临定色难、易挂灰及青筋烟比例高等问题（张译丹等，2020）。褐变反应是烘烤中烟叶色泽与香气品质形成的关键步骤，过度褐变易造成烟叶挂灰、黑糟，而叶色作为烟叶收购分级中的第二分组因素，对烤烟等级的评定具有重要影响。因此，采取有效的采烤措施，提高上部叶可用性及减少褐变反应，对保证卷烟产品的烟气浓度和丰富烟香具有重要意义。【前人研究进展】利用带茎采烤技术降低烟叶酶促褐变反应，改善上部烟叶烤后品质，是当前烤烟上部叶技术创新的重要研究方向（仙立国等，2020；邹凯等，2021）。近年来，通过带茎采烤减少烟叶挂灰褐变、提高上部叶可用性越来越受到重视，多关注于酶促褐变和水分迁移等（黄浩等，2014；蒋博文等，2018；魏硕等，2019）。带茎烘烤中茎秆的自由水向叶片内部发生运移，在变黄后组织内部仍保持较高的自由水含量，在烘烤过程中能有效促进烟叶有机物质的降解与转化，外观质量明显提高（王晓宾等，2008）。而在果蔬方面，许多研究表明褐变的发生与脂肪酸代谢有着密切的联系，龙眼果皮脂氧合酶（LOX）活性和膜脂不饱和脂肪酸的降解加速能引起龙眼果皮褐变加深（陈艺晖等，2011）；通过降低板栗不饱和脂肪酸含量，可减轻加工贮藏过程中的褐变反应（杨芳等，2013）；通过调节玉米、余甘子的贮藏温度，可减轻褐变，抑制脂肪酸积累（张福平等，2014；洪宇等，2020）；延缓双孢蘑菇脂质过氧化进程，能降低其褐变指数（李静等，2019）。上述研究结果均表明果蔬类的脂肪酸代谢和氧化是影响褐变进程的重要因素之一。【本研究切入点】烟叶烘烤过程中褐变是多因素综合影响的结果，前人多关注于酶促褐变，对烟叶脂质氧化褐变研究甚少，不同采烤方式下脂质氧化对烟叶褐变的影响研究更是鲜有报道。【拟解决的关键问题】设置4种采烤方式，从细胞生物学和分子方向对不同采烤方式下脂质氧化与烤烟上部叶的褐变关系进行系统研究，为提高烤烟上部叶可用性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020—2021年在广元市剑阁县普安镇基地开展，品种为云烟87。选择在当地烟叶适熟季节，采收落黄均匀、长势一致的烟叶，带茎采收烟叶选取叶色均匀，叶面积大小、茎秆粗细基本一致烟叶及其茎秆为试验材料，有效留叶数为18片（包括脚叶3片），烟株采收至上部叶6片时，自顶部向下标记为1～6叶位。

1.2 试验设计

烟叶带茎方式设4个处理：CK，常规分次采收（正常采烤）；T1，3～4叶位一次性带茎割收（2片烟叶带茎烘烤）；T2，2～5叶位一次性带茎割收（4片烟叶带茎烘烤）；T3，1～6叶位一次性带茎割收（6片烟叶带茎烘烤）。茎切口距离最近叶柄1～2 cm，每处理5杆置于同一密集烤房中棚观察窗位置进行烘烤，在变黄关键期干球温度达42 ℃、烟叶黄片青筋主脉发软、烘烤72 h时取样，选取每处理第3叶位的10片烟叶立即运往实验室；采用半叶法将烟叶一分为二并去除主脉，一半叶片4 ℃保存用于超微结构观察，另一半叶片放入液氮内速冻后置于-80 ℃冰柜储存，用于酶活性与基因测定，每处理3次重复。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 褐变程度测定选取放置取样窗口的每处理5片烟叶，用于烘烤过程中颜色变化的测定。参考汪代斌等（2017）的方法，采用Photoshop像素法计算烟叶变褐部分面积与总叶片面积（图1），从烟叶烘烤开始每隔24 h进行褐变比例统计，测定褐变程度，进而计算褐变速度。褐变面积/叶片面积＜15%为轻度褐变，褐变面积/叶片面积≥15%为中度及以上褐变。

1.3.2 超微结构分析参考郑小雨等（2020）的方法，在变黄期42 ℃烘烤72 h时选取各处理叶片第5～第7支脉之间右侧相同的位置，用手术刀切成1 mm×1 mm小块，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS缓冲液配制）中固定。透射电镜观察角质层：用1%锇酸（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS缓冲液配制）固定，经100%丙酮脱水后用Epon812环氧树脂包埋聚合；用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片机（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）切出超薄切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后，再用JEM-1400Plus型透射电镜（日本电子株式会社）进行观察并拍照，每处理观察10个视野。用Photoshop 2020进行标注处理。

1.3.3 LOX活性测定 LOX活性按照酶活试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书方法进行测定。

1.3.4 脂肪酸含量测定烘烤中烟叶脂肪酸等成分参考YC/T 288—2009《烟草及烟草制品多元酸（草酸、苹果酸和柠檬酸）的测定气相色谱法》的方法进行测定。

1.3.5 烤后烟叶分级参考GB 2635—1992《烤烟》对烤后烟叶进行分级，计算烤后烟叶的等级结构。

1.3.6 基因表达量分析在变黄期42 ℃烘烤72 h时选取各处理叶片，采用TRIzol法提取烟叶总RNA，通过随机引物法反转录合成cDNA。根据Gen-Bank发布的、、、、和脂肪酸代谢相关基因，以L25烟草核糖体蛋白作内参基因（GenBank：L18908.1）（表1），采用2算法（黄化刚等，2016）进行分析，每个样品3次重复。

1.4 统计分析

使用检验比较2个样本组，结果以平均值±标准误差表示，使用SPSS 21.0进行统计分析，Origin 2022制图。

2 结果与分析

2.1 烘烤过程中烟叶褐变比例与烤后烟叶褐变比例统计结果

通过对比发现，烘烤过程中不同采烤处理的上部叶颜色变化趋势基本相同（图2-A），烟叶褐变速度排序为：6片烟叶带茎烘烤处理＜4片烟叶带茎烘烤处理＜2片烟叶带茎烘烤处理＜正常采烤处理（图2-B）。由此可知，与正常采烤处理相比，随着带茎叶片数的增加，褐变反应逐渐减轻，说明带茎处理在降低褐变程度上起着一定作用。

由图2-C可知，不同采烤处理烟叶褐变比例排序为：2片烟叶带茎烘烤处理＞正常采烤处理＞4片烟叶带茎烘烤处理＞6片烟叶带茎烘烤处理，其中4片和6片烟叶带茎烘烤处理烟叶烤后褐变比例较正常采烤处理分别减少1.34%和4.22%（绝对值）。与正常采烤处理烟叶相比，2片、4片和6片烟叶带茎烘烤处理分别提高上等烟比例20.71%、22.02%和43.99%，其中6片烟叶带茎烘烤处理的中上等烟比例最高，较正常采烤处理提高1.67%（绝对值）。

2.2 烟叶细胞超微结构观察结果

如图3所示，变黄期42 ℃烘烤72 h时，带茎烘烤处理明显降低烟叶角质层厚度。正常采烤处理上部叶角质层较厚，达0.436 μm，2片、4片和6片烟叶带茎烘烤处理较正常采烤处理分别减少34.09%、43.86%和46.40%，其中6片烟叶带茎烘烤处理的角质层最薄，显著低于正常采烤处理（＜0.05，下同）。说明对比正常采烤处理上部叶，带茎处理烟叶角质层更薄。

2.3 烟叶的脂肪酸含量分析结果

不同采烤处理对上部叶变黄期42 ℃烘烤72 h时脂肪酸含量的影响如图4-A所示，烤后烟叶均检测到7种脂肪酸，C14：1（肉豆蔻酸）含量表现为6片烟叶带茎烘烤处理＞4片烟叶带茎烘烤处理＞2片烟叶带茎烘烤处理＞正常采烤处理，但C18：2（亚油酸）、C16：0（棕榈酸）、C18：0（硬脂酸）、C20：0（花生酸）、C18：1（油酸）和C18：3（亚麻酸）含量均表现为正常采烤处理高于带茎采烤处理。正常采烤处理烟叶的脂肪酸总量分别是2片、4片和6片烟叶带茎烘烤处理的1.12、1.15和1.17倍。其中6片烟叶带茎烘烤处理的C16：0和C18：2含量较正常采烤处理分别降低15.73%和12.72%，差异达显著水平；C16：0、C18：2和C18：0含量均表现为正常采烤处理＞2片烟叶带茎烘烤处理＞4片烟叶带茎烘烤处理＞6片烟叶带茎烘烤处理，含量随叶片数增加而下降。6片和2片烟叶带茎烘烤处理的C18：1和C18：3含量分别为5.19和5.40 mg/g，较正常采烤处理烟叶含量分别降低20.64%和17.42%，分别达极显著（＜0.01，下同）和显著差异。

在烘烤变黄关键期，LOX活性表现为正常采烤处理＞2片烟叶带茎烘烤处理＞4片烟叶带茎烘烤处理＞6片烟叶带茎烘烤处理，其中6片烟叶带茎烘烤处理与正常采烤处理间存在显著差异（图4-B）。说明6片烟叶带茎烘烤处理烟叶在一定程度上饱和与不饱和脂肪酸的积累较多，脂质降解氧化和胁迫应答能力更强。

2.4 不同采烤处理烟叶脂肪酸代谢相关基因表达量的变化

以正常采烤处理烟叶的基因表达量为1，通过对4种采烤处理变黄期42 ℃烘烤72 h时6个脂肪酸代谢基因进行表达分析（图5），发现对比正常采烤处理烟叶，4片和6片烟叶带茎烘烤处理各脂肪酸代谢基因表达量均下调，且趋势相似，带茎与不带茎处理烟叶之间的表达差异较大，带茎烘烤处理中6片烟叶的脂肪酸代谢影响作用最大，其表达量均远小于正常采烤处理烟叶，、、和基因相对表达量分别显著降低56.03%、46.35%、53.79%和55.02%，和相对表达量分别极显著降低87.28%和90.96%。

2.5 烟叶脂质氧化指标相关分析结果

分析变黄期42 ℃烘烤72 h时烟叶脂肪酸含量、角质层厚度和LOX活性之间的相关性，结果（图6）显示，角质层厚度与C16：0呈显著正相关，与C18：0和脂肪酸总量呈极显著正相关，相关系数分别为0.977、0.991和0.997。C16：0、C18：1+C18：3与LOX活性分别呈显著和极显著正相关，说明变黄期LOX活性对烤后烟叶棕榈酸、油酸和亚麻酸含量的积累具有正向作用。

3 讨论

本研究以不同采烤处理的云烟87上部叶为试材，烘烤中烟叶随时间变化和带茎处理叶片数量增加而褐变速度减缓，烟叶褐变程度减轻，且4片和6片烟叶带茎处理的上等烟比例提高，烟叶烤后褐变比例分别减少1.34%和4.22%（绝对值），与黄浩等（2014）的研究结果一致，即6片烟叶带茎烘烤处理效果最佳。烟叶角质层主要由角质和蜡质组成，角质是一种由甘油、羟基脂肪酸及环氧脂肪酸组成的聚酯聚合物。大量研究表明植物脂肪酸代谢（脂质氧化）与角质层形成密切相关，角质层可作为研究脂肪酸代谢的一个参考指标（张婧等，2015；陈伟等，2016；杨绿竹等，2020）。表皮角质能有效调控表皮细胞的渗透性，阻止叶片中水分的非气孔性散失（徐呈祥等，2021），脂质含量和角质厚度均发挥着重要作用。电镜检测结果表明，在烘烤变黄关键期，正常采烤处理烟叶的角质层较厚，带茎处理烟叶角质层厚度随叶片数增加而逐渐减少，说明带茎处理对烘烤中烟叶角质蜡质具有重要影响。随着烘烤温度的逐渐升高，角质层对外界环境因子的响应较敏感，通过改变角质层厚度构建有效防御机制，可减少胁迫因子的作用，延缓烟叶内部的水分散失，与张译丹等（2020）研究烘烤过程中表皮微观形态特征的结果相一致。

植物角质蜡质的起始合成在表皮细胞的质体中进行，主要由长链脂肪酸组成（Li et al.，2013）。进一步对比4种采烤处理变黄期42 ℃烘烤72 h时烟叶7种脂肪酸含量，发现大多呈现出相同趋势，即随着带茎处理叶片数的增加，脂肪酸含量下降，其中棕榈酸、亚油酸、油酸和亚麻酸含量存在较大差异。说明不同采烤处理中脂肪酸总量主要受棕榈酸、亚油酸、油酸和亚麻酸含量的影响，但不同脂肪酸在烘烤后沉积存在特异性，且可能与脂肪酸各自不同的生理功能有关。LOX是参与烟叶生长过程中脂肪酸代谢途径的关键酶（罗子敬等，2017），其通过诱导不饱和脂肪酸中亚麻酸和亚油酸的氧化从而影响叶片的脂质氧化进程（李君兰等，2022），带茎处理烟叶中LOX活性明显降低。相关分析结果表明，角质层厚度与脂肪酸总量、LOX活性与油酸和亚麻酸均呈极显著正相关，提示油酸、亚麻酸和LOX可能是烟叶脂肪酸代谢的主要贡献物质。本研究发现，带茎处理在烘烤过程的湿热条件下，能减弱LOX活性，烟叶细胞器和质膜的超微结构发生改变或解体的速度减慢，氧化衰老速度缓慢，减少了不饱和脂肪酸油酸、亚麻酸、亚油酸及饱和脂肪酸硬脂酸相对含量的积累，从而减轻烟叶褐变程度，其中6片烟叶带茎采烤处理的效果最佳。

烟叶烘烤过程中发生的一系列脂肪酸氧化生理生化变化，是复杂的内在分子机制调控结果。在本研究中，烟叶在高温高湿环境下脂肪酸代谢相关基因表达情况与其采烤处理密切相关。选取的6个基因中，对比正常采烤处理烟叶，4片与6片烟叶带茎烘烤处理表达量均下调，且趋势相似。醛脱氢酶（ALDHs）是一个超家族蛋白，其依赖于NAD（P），能氧化许多内源依赖性酶、脂肪族和芳香族醛，生成羧酸（刘美兰等，2017），基因在带茎处理变黄期42 ℃烘烤72 h时显著下调。脂氧合酶基因家族（LOXs）参与调控LOX活性和功能，在调控脂质氧化过程中发挥重要作用（胡位荣等，2005），2片、4片和6片烟叶带茎烘烤处理中基因的相对表达量分别降低12.17%、22.59%和56.03%，与LOX活性降低结果一致。脂质转移蛋白（LTPs）被证明可能有助于角质单体通过细胞壁向角质层的转运（李晓佩等，2020），对比正常采烤处理烟叶，随着带茎烘烤处理烟叶叶片数量的增加，基因相对表达量逐渐下调，与带茎处理烟叶烘烤过程中表皮蜡质积累量减少结果一致，表明该基因在蜡质层形成过程中起关键作用；MYB转录因子参与蜡质的生物合成与转录，对蜡质合成途径中信号传导与调控起着十分重要的作用（张敏等，2017），蜡质突变体基因（）类基因催化反应是超长链脂肪酸延伸的最后一步（Zheng et al.，2005），类基因通过等基因的上调来激活蜡质合成（Dubos et al.，2010）。、和上游调控因子表达量在不同采烤处理中变化趋势相似，且具有显著差异，暗示和家族基因在脂肪酸代谢途径中发挥关键作用。

目前烟叶调制过程中变黄末期与定色阶段的褐变研究，多集中于酚类底物在多酚氧化酶作用下迅速转化为大量醌，最终引起褐变的酶促褐变反应。在果蔬储存和加工中脂质氧化引起褐变等相关研究也逐渐成为热点，除了酚类物质，糖苷类和脂质类也可能是褐变的底物，但在烟叶烘烤中的影响鲜见相关报道，特别是对烟叶脂质氧化研究甚少。综上，本研究初步从细胞生物学、物质代谢和分子层面系统分析不同采烤处理在上部叶脂质氧化与烟叶褐变中的差异，可为证明脂质氧化参与烟叶褐变提供理论依据。虽然本研究初步证实了带茎采烤处理对相关脂肪酸代谢基因有抑制表达作用，通过减缓脂质氧化影响烟叶的褐变，且效果显著，但相关机制十分复杂，在分子水平上的证据仍不充分，后期将通过目的基因克隆和转基因技术，对脂肪酸代谢关键基因在调控烟叶褐变过程中的功能和作用机理做进一步研究。