高效液相色谱法测定牛奶中糠氨酸含量
2022-09-03纪坤发杨美丰杨爱君罗少杰曹学思
何 瑛,纪坤发,杨美丰,杨爱君,罗少杰,曹学思
广东燕塘乳业股份有限公司,广东广州 510507
0 引言
牛奶中富含多种营养物质,被称为“白色血液”,是为数不多的全价食品之一,也是微生物生长繁殖的良好培养基。生乳中含有大肠杆菌、沙门氏菌等病源微生物和腐败菌,为了保证牛奶的饮用安全并延长货架期,在加工过程中需要对生乳进行杀菌处理。热处理是乳制品加工中最常用的杀菌工艺[1],适宜的热处理还可以使不易吸收的大分子蛋白质降解成人体易于消化吸收的小分子蛋白质,提高牛奶的营养价值。但是,过度的热处理会使牛奶中的蛋白质、乳糖等发生不同程度的物理及化学变化,如美拉德反应、乳糖异构化以及蛋白质变性等,使牛奶的感官和营养价值下降,甚至产生有害物质,随着热处理强度的增加,有害物质的含量也会不同程度地增加[2]。因此,在保证牛奶卫生安全的前提下,降低对其营养物质的损伤是热处理工艺的控制要点。然而,目前我国国家标准中尚未有对各种热处理工艺的规范和指导,对生乳热处理强度的评价以及热敏感指标的筛选就显得尤为重要。2013年,原农业部奶产品质量安全风险评估试验室向国家建议实施优质乳工程,通过对国产奶和进口奶进行科学系统的比较评估,确定牛奶中糠氨酸可以作为品质高低的标记物。
糠氨酸(ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸),又称“呋喃素”,是美拉德反应初期产生的阿姆瑞德(Amadori)化合物酸水解产生的稳定产物[3],其在牛奶中的含量很大程度取决于对牛奶的热处理强度和储存条件,可以很好地体现牛奶美拉德反应的程度[4]。早在1992年,欧盟各国政府便将糠氨酸质量分数作为评价液态乳品质的一个重要指标。此外,欧盟和国际乳品联合会分别于1996年和1998年提出以糠氨酸和乳果糖作为衡量复原乳的标志物[5],我国原农业部也在2005年发布行业标准将巴氏奶、超高温灭菌乳中的糠氨酸含量作为判定是否为复原乳的因素之一[6]。
目前,牛奶中糠氨酸的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、超高效液相色谱串联质谱法(UPLCMS/MS)、毛细管色谱串联质谱法(CE-MS/MS)、气相色谱串联质谱法(GC-MS)、稳定同位素稀释-质谱联用法和表面荧光光谱法等[3,7,8]。其中,质谱法虽然分离度较高,但仪器昂贵、维护成本高、对操作人员的要求也较高;表面荧光光谱法灵敏度较低,一般用于半定量分析[8];高效液相色谱法是使用最早且应用最广的检测方法,国际乳品联合会(IDF)标准ISO 18329—2012[9]和我国农业行业标准《NY/T 939—2016 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》[6]中使用的检测方法均为高效液相色谱法,其具有高效、高灵敏度、应用范围广、仪器普遍率高、维护成本较低等优势。本文主要通过从色谱柱、流动相和酸水解条件等方面对NY/T 939-2016进行研究,建立使用高效液相色谱来测定牛奶中糠氨酸含量的方法,为乳品企业提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
高效液相色谱仪(Agilent 1200),美国Agilent公司;凯氏定氮仪(FOSS KJELTEC 8100),丹麦FOSS公司;十万分之一天平(Mettler Tledo XSR205DU),瑞士Mettler Tledo公司;超纯水系统(Milli-Q Reference A+),默克化工;精密干燥箱(FD115型),德国爱安姆公司;可调移液器,德国 Brand公司;涡旋振荡器,海太集团;20 mL具塞耐热玻璃试管。
甲醇、三氟乙酸(色谱纯),德国Merck公司;浓盐酸(优级纯),广州化学试剂厂;本试验中用水符合《GB/T 6682—2008分析试验室用水规格和试验方法》[10]中一级水的规定。
1.2 试验方法
1.2.1 试验原理
试样经盐酸水解后测定蛋白质含量,消解液经稀释后用高效液相色谱仪分析,经DAD检测器(波长280 nm)测定,外标法标准曲线定量[6]。
1.2.2 样品前处理
吸取2.00 mL样品,置于密闭耐热试管中,加入6.00 mL 10.6 mol/L盐酸溶液,混匀,密闭试管。然后将其置于干燥箱中,在110 ℃下加热水解过夜(20~23 h)。加热约1 h后,轻轻摇动试管。加热结束后,将试管从干燥箱中取出,冷却后混匀,用Wateman 1号滤纸干过滤,保留滤液待测。试样水解液中蛋白质含量的测定:吸取2.00 mL试样水解液,按GB 5009.5—2016[11]的规定测定试样水解液中的蛋白质含量。试样水解液中糠氨酸含量的测定:吸取0.50 mL试样水解液,加入2.50 mL超纯水,混匀,过0.22 μm PVDF针式滤膜,滤液进行上机检测。
1.2.3 试剂配制
(1)盐酸溶液(3 mol/L):在7.5 mL水中加入2.5 mL浓盐酸,混匀。
(2)盐酸溶液(10.6 mol/L):在12 mL水中加入88 mL浓盐酸,混匀。
(3)流动相A(含0.1 %三氟乙酸的5%甲醇水溶液):取949 mL纯水倒入1 L的容量瓶中,加入50 mL甲醇,加入1 mL三氟乙酸后立即盖上盖子,轻摇至三氟乙酸全部溶解没有雾气,超声脱气15 min。(4)流动相B(含0.085 %三氟乙酸的95%甲醇水溶液):取950 mL甲醇倒入1 L的容量瓶中,加入49.15 mL纯水,加入0.85 mL三氟乙酸后立即盖上盖子,轻摇至三氟乙酸全部溶解没有雾气,超声脱气15 min。
1.2.4 色谱条件
经过测试,高效液相色谱仪的色谱条件如下。
色谱柱:Waters HSS T3150 mm×4.6 mm,5.0 μm粒径;进样量:10 μL;柱温:28 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长:280 nm;流动相A为含0.1 %三氟乙酸的5 %甲醇水溶液、流动相B为含0.085 %三氟乙酸的95 %甲醇水溶液;洗脱梯度见表1。
表1 洗脱梯度
利用流动相A和流动相B的混合液(50∶50)以1 mL/min的流速平衡色谱系统。然后,用初始流动相平衡系统直至基线稳定。注入10 μL 3 mol/L盐酸溶液,以检测溶剂的纯度。
1.3 标准工作曲线的制作
1.3.1 糠氨酸标准储备液的配制(250 mg/L):将糠氨酸标准品按标准品证书提供的肽纯度系数(0.69)换算后,用3 mol/L盐酸溶液配制成标准储备液,-20 ℃下可储存24 个月。
1.3.2 糠氨酸标准工作液的配制:将糠氨酸标准储备液放至室温,准确吸取糠氨酸标准储备液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL,用3 mol/L的盐酸溶液定容至25 mL,配制成浓度为0.06 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L、4.00 mg/L的标准工作液,4 ℃下可储存21 天[8]。
1.3.3 标准工作曲线的制作:糠氨酸标准工作液通过液相色谱仪分析,以标准工作液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.4 计算
1.4.1 试样测定
将待测溶液上机测定,根据计算公式得到样品中糠氨酸的含量。
1.4.2 计算公式
(1)试样中糠氨酸含量按公式①计算
糠氨酸含量以质量分数F计,数值以毫克每百克蛋白质(mg/100 g蛋白质)表示。计算结果保留至小数点后一位。
式中:F表示试样中糠氨酸含量,mg/100 g蛋白质;At表示测试样品中糠氨酸峰面积的数值;Astd表示糠氨酸标准溶液中糠氨酸峰面积的数值;Cstd表示糠氨酸标准溶液的浓度,mg/L;D表示测定时稀释倍数,D=6;m表示样品水解液中蛋白质浓度,g/L。
(2)巴氏杀菌乳杀菌结束时糠氨酸的含量按公式②计算
式中:FT表示巴氏杀菌乳中糠氨酸含量,mg/100g蛋白质;F表示试样中糠氨酸含量,mg/100 g蛋白质。
(3)UHT灭菌乳灭菌结束时糠氨酸的含量按公式 ③计算
式中:FT表示灭菌乳中糠氨酸含量,mg/100g蛋白质;F表示试样中糠氨酸含量,mg/100g蛋白;0.7表示常温下样品每储存一天产生的糠氨酸含量,mg/100g蛋白质;t表示样品在常温下储存天数。
2 试验方法的优化
本文分别从色谱柱的选择、流动相的优化和酸水解条件等方面对试验方法进行优化。
2.1 色谱柱的选择
糠氨酸具有较强的极性化学性质,根据其结构特点,适合检测使用的色谱柱有氨基酸专用柱、C18色谱柱和HILIC色谱柱等[12]。本文选择常见的C18色谱柱进行筛选,以期在乳品企业日常使用过程中不用频繁更换色谱柱,能同时满足牛奶中三聚氰胺、苯甲酸、山梨酸和黄曲霉毒M1等风险项目的检测使用。由于糠氨酸标准溶液和待测样品均经过盐酸处理,pH值较低,此外,流动相中含有少量的三氟乙酸,pH值低至1.71,且洗脱程序中需长时间走纯水流动相,因此需要选择较耐受纯水溶液及低酸度的宽 pH范围色谱柱。
试验过程中筛选了试验室常用的安捷伦XDB-C18、Waters BEH C18和Waters HSS T3色谱柱,最终选择了更耐受高比例水相及低pH流动相的HSS T3色谱柱,其对目标物的保留效果良好,能有效分离目标化合物和干扰物,测试糠氨酸样品可以达到700 个以上,且能适用于试验室多种风险项目的日常检测,总测试样品可以达到1200 个以上,相对于普通C18反相柱仅可检测150~300 个样品有了明显改进[13,14]。
2.2 流动相的优化
牛奶中富含多种氨基酸成分,在使用液相色谱对糠氨酸进行检测的过程中,存在许多其他氨基酸类干扰物等,因此优化流动相十分重要。试验过程中比较了酸性体系(0.1 % 三氟乙酸水溶液)和非酸性体系(6 g/L乙酸铵溶液)分别与甲醇、乙腈的流动相体系组合对目标化合物的分离情况,最终选择以三氟乙酸作为离子对试剂,甲醇作为有机改性剂的流动相体系,经过对流动相比例的反复优化,最终确定色谱条件(表1)。在此条件下,色谱基线平稳,目标物质峰型良好(图1),分离效果良好,且避免了长时间水相冲洗对色谱柱选成的伤害,延长了色谱使用寿命。
图1 糠氨酸标准品(1.0 mg/L)色谱图
2.3 酸水解方法的确定
目前对糠氨酸的酸水解方法包括传统加热水解、蒸汽水解、微波消解等方法[7]。本文采用传统加热水解法对样品进行前处理。研究表明,酸水解时盐酸浓度对形成糠氨酸的产率有很大影响,且低浓度的盐酸不能完全阻止水解过程中美拉德反应继续产生新的糠氨酸[7、11、15],试验最终选择使用10.6 mol/L盐酸溶液进行酸水解试验。
取质控样品按1.2 试验方法进行检测,其中酸水解时间分别设置为12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h,检测结果如表2所示。
表2 酸水解时间对糠氨酸含量的影响
从表2可以看出,酸水解时间达20 h后,质控样品糠氨酸含量趋于稳定。试验过程中可以根据具体时间安排进行酸水解处理,采用110 ℃加热水解20 ~23 h。尉鑫欣[14]对酸水解时间对糠氨酸形成的影响进行研究发现,当糠氨酸浓度在700~1100 μg/L时,水解16 h后糠氨酸含量基本无显著变化;陈冲冲[16]在对酸水解时间进行优化试验中发现,当糠氨酸浓度在122.1 mg/100g蛋白质时,水解12 h后糠氨酸含量基本无显著变化,这可能是由于样品中糠氨酸的含量不同造成的。在乳品企业糠氨酸的日常监测过程中,由于热处理强度不同,纯牛奶中糠氨酸含量可能达到200 mg/100g蛋白质以上,需要适当延长酸水解时间以确保反应完全。
3 结果与分析
根据《GB/T 27417—2017合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[17],本文从线性范围、检出限和定量限、精密度和正确度等方面来确认方法的可行性。
3.1 线性范围
在试验选定的色谱条件下,将1.3.2中所配制的标准工作液依次上机测定,每个浓度重复测定6 次,得到标准工作液每个浓度点的色谱平均峰面积及其相对标准偏差,标准工作液重复测定结果如表3,标准工作液色谱图如图1。
表3 糠氨酸标准工作液重复测定结果
从表3可知,标准工作液每个浓度点上机检测的相对标准偏差在0.13%~1.46%之间,重复性良好。以标准工作液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,如图2所示。制得的标准浓度范围(0.06~4.00 mg/L),回归方程(y=37.996360 4x+0.441324 7),相关系数(R2=0.9997),线性关系良好,可用于实际分析检测。
图2 糠氨酸标准工作曲线
3.2 检出限和定量限
根据测定结果,取3倍信噪比(S/N)计算检出限,取10倍信噪比(S/N)计算定量限,得到方法的检出限为0.02 mg/L,定量限为0.065 mg/L。将该浓度代入1.4.2(1)公式①计算,m值取牛奶中蛋白质水解液的平均浓度0.8 g/L,得到方法的检出限为1.5 mg/100g蛋白质,定量限为4.9 mg/100g蛋白质[18,19]。许多报道显示,生乳、巴氏杀菌乳和灭菌乳中的糠氨酸的含量为3.00~5.73 mg/100g蛋白质、2.86~68.8 mg/100g蛋白质和35~300 mg/100g蛋白质[16,20~24],方法的检出限和检测范围基本可以满足企业日常监测需求。
3.3 精密度和回收率试验
选用本底较低的巴氏杀菌乳作为加标回收底物,分别吸取一定量的糠氨酸标准储备液,配制成加标浓度5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、30 mg/L的加标样品,充分混匀后按1.2的试验方法进行检测,每个样品平行测定6 次,取平均值计算回收率,试验结果见表4,巴氏杀菌乳中糠氨酸色谱图见图3。
表4 糠氨酸加标回收试验结果
图3 巴氏杀菌乳中糠氨酸色谱图
从表4可知,在5~30 mg/L的加标浓度下,巴氏杀菌乳中糠氨酸的平均加标回收率在91.48%~91.73%之间,RSD在0.13%~0.37%之间,方法的加标回收率稳定,正确度高,重复性良好,可作为实际样品的准确定量检测方法。
3.4 样品的检测
取3 个不同热处理强度的牛奶样品,按1.2 试验方法进行检测,每个样品平行测定6 次,并与第三方检测机构(北京畜牧研究所)的结果对比,检测结果见表5。
从表5可以看出,无论是低浓度样品还是高浓度样品,本方法检测结果与第三方机构检测结果偏差均<1.00%。
表5 糠氨酸检测结果比对
4 讨论和结论
目前测定牛奶中糠氨酸含量的方法很多。卢沛明等[25]建立高效液相色谱法检测乳制品中的糠氨酸含量,该方法标准曲线线性(R2=1.000),方法检出限0.5 mg/kg,加标回收率81.0%~87.2%,RSD值小于3.5 %;张文青等[24]建立高效液相色谱法检测巴氏杀菌乳中的糠氨酸含量,该方法标准曲线线性(R2=0.9990),方法检出限2.8 mg/100g蛋白质,加标回收率84.62%~101.4%,RSD值≤1.0%;冯婉莹等[15]建立UPLC-Q-TOF/MS法测定液态乳中的糠氨酸,该方法标准曲线线性(R2=0.9997),方法检出限为250 ug/kg,加标回收率84.0%~86.2%,RSD值1.08 %~4.01%;黄文强等[13]建立液相色谱法测定乳制品中的糠氨酸,该方法标准曲线线性(R2=0.9990),加标回收率90.6 %~93.8 %,RSD值为0.73%。本文改良高效液相色谱法检测牛奶中糠氨酸的含量,方法标准曲线线性良好(R2=0.9997),方法检出限1.5 mg/100g蛋白质,定量限为4.9 mg/100g蛋白质,平均加标回收率在91.48%~91.73%之间,RSD在0.13%~0.37%之间,测得结果与第三方机构检测结果偏差小于1.00%,比上述方法具有优势,不但灵敏度更高,检测结果更准确、重现性更好,回收率更高,操作过程更简便,且色谱柱适用范围广、使用寿命长,适用于乳品企业对糠氨酸的日常监测。