circ_0000212靶向微小RNA-1283对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

吴娜萍, 王 磊, 张 磊, 方 琦

(江苏省常州市第一人民医院 乳腺外科, 江苏 常州, 213000)

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种异质性乳腺癌亚型，具有高侵袭性、高转移风险，其高侵袭性可导致患者预后不佳，引起高死亡风险，且由于临床诊疗过程的复杂性和困难性，导致患者身体健康状况低下，心理负担加剧。确定潜在的分子靶点，研究新型小分子药物对临床治疗TNBC具有一定的指导价值[1-3]。非编码RNA参与TNBC肿瘤疾病发展过程，并发挥作用[4]。环状RNA(circRNA)是非编码RNA的一种，可通过多种机制在癌细胞的进展中发挥重要作用, circRNA具有高丰度、高稳定性以及特异性等特点，有望为肿瘤的诊断和治疗提供新视角[5]。circ_0000212(circSFMBT2)来源于SFMBT2, 位于chr10: 7405839-7423911, 其充当微小RNA(miR)-1283-140-3p的海绵调控TCEB3, 进而促进宫颈癌的进展[6]。在胃癌组织和细胞中circSFMBT2表达上调，丹皮酚可通过circSFMBT2/miR-665轴抑制胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移、侵袭和谷氨酰胺分解，并诱导细胞凋亡[7]。然而，目前有关circ_0000212对TNBC细胞活动的影响及相关机制的研究较少。生物学软件预测发现circ_0000212与miR-1283有结合位点。研究[8]报道, miR-1283高表达通过靶向ATF4而有效抑制胶质瘤细胞的活动。下调circ-TTBK2, 可通过调节miR-1283和CHD1抑制胶质瘤的发展[9]。但miR-1283对TNBC细胞活动的具体影响并未明确，且其与circ_0000212之间的关系尚未阐明。本研究探讨TNBC细胞中circ_0000212的表达情况及其对细胞增殖、凋亡生理过程的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2017年1月—2021年1月常州市第一人民医院经病理确诊且相关信息完整的TNBC患者41例(年龄37～66岁)作为研究对象，取其手术切除的癌组织及癌旁组织进行深入分析，所有患者术前均未接受手术以及放疗、化疗, 41例患者及其家属均知情并同意。本研究经伦理委员会审核批准[批准号: (2021)科132号)]。

1.2 细胞株与试剂

TNBC细胞株MDA-MB-231(美国ATCC); RPMI-1640培养基、凋亡检测试剂盒(美国Sigma公司); Trizol试剂(美国Invitrogen); 荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物); CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所); RIPA蛋白裂解液(上海贝博-Bestbio); 双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国AAT Bioquest)。

1.3 细胞处理与分组

MDA-MB-231细胞常规培养于RPMI-1640培养基中，将circ_0000121干扰表达载体及阴性对照、circ_0000121过表达载体及阴性对照、miR-1283模拟物及阴性对照转染至MDA-MB-231细胞，记为si-circ_0000212组、si-NC组、pcDNA-circ_0000212组、pcDNA组、miR-1283组、miR-NC组; 在MDA-MB-231细胞共转染circ_0000121干扰表达载体与miR-1283抑制剂或阴性对照，记为si-circ_0000212+anti-miR-1283组、si-circ_0000212+anti-miR-NC组。

1.4 反转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circ_0000212和miR-1283的表达水平

提取TNBC组织、癌旁组织及各组MDA-MB-231细胞的总RNA, 合成cDNA后，按照荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR，PCR反应体系: 2.0 μL反转录产物、10.0 μL SYBR Green Mix和上、下游引物各0.5 μL, 7.0 μL无菌水; 循环条件: 95 ℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环; 融解曲线: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s。相对表达量用2-△△Ct法计算。内参为U6、GAPDH, 引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8检测细胞活性

各组MDA-MB-231细胞在96孔板中持续培养1、2、3 d后，分别加入CCK-8试剂10 μL, 持续孵育2 h, 应用酶标仪检测光密度值(OD), 波长参数为450 nm。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成数

取对数生长期MDA-MB-231细胞，以每孔500个细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔，培养2周出现肉眼可见克隆时终止培养，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2遍，用甲醇固定细胞15 min, 然后施加结晶紫进行染色，时间30 min，显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组培养48 h的MDA-MB-231细胞，预冷的PBS漂洗2次，加入300 μL的结合缓冲液，并进行细胞重悬，然后分别加入5 μL的碘化丙啶(PI)、Annexin V-FITC并充分混匀，置于避光环境中持续孵育10 min, 采用流式细胞仪计算细胞凋亡率，上机前，补加200 μL的结合缓冲液。

1.8 活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase3)、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(cleaved-caspase9)蛋白水平测定

采用RIPA蛋白裂解液提取MDA-MB-231细胞总蛋白，各组蛋白上样量50 μg。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后将蛋白转至聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗体4 ℃孵育过夜; 洗膜后加入二抗室温孵育2 h, 暗室中曝光显影，再浸入定影液，成像后用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。

1.9 双荧光素酶报告实验

扩增含有miR-1283互补位点的野生型(WT)-circ_0000212序列或突变型(MUT)-circ_0000212序列，将其插入pGL3荧光素酶报告基因载体，合成WT-circ_0000212和MUT-circ_0000212荧光素酶载体。在接种于96孔板的MDA-MB-231细胞中，分别将miR-NC、miR-1283与WT-circ_0000212和MUT-circ_0000212进行共转染，转染48 h后，测量萤火虫和海肾荧光素酶活性，并将海肾荧光素酶活性用作对照。荧光素酶活性测定相关操作严格按照说明书完成。

将circ_0000121干扰表达载体、过表达载体及阴性对照转染至MDA-MB-231细胞，用RT-qPCR检测miR-1283的表达水平。

1.10 统计学分析

2 结 果

2.1 circ_0000212和miR-1283在TNBC组织、癌旁组织中的表达

应用RT-qPCR检测组织中circ_0000212和miR-1283的表达水平，结果显示, circ_0000121在TNBC组织中的表达水平高于癌旁组织, miR-1283表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 circ_0000212和miR-1283在TNBC组织中的表达

2.2 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖的影响

转染si-circ_0000212后，应用RT-qPCR检测circ_0000121表达水平，结果显示circ_0000121表达水平降低，表明转染成功。进一步通过CCK-8法及克隆形成实验检测细胞活力及克隆数，结果显示，转染si-circ_0000212后，MDA-MB-231细胞活力水平降低，细胞克隆活动呈下降态势(P<0.05)。见图1、表3。

图1 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞克隆形成的影响

表3 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖的影响

2.3 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞凋亡的影响

转染si-circ_0000212后，分别用流式细胞术及蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡及蛋白表达水平，结果显示, si-circ_0000212组MDA-MB-231细胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平高于si-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表4。

A: 凋亡相关蛋白表达; B: 细胞凋亡流式图。图2 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞凋亡的影响

表4 干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.4 circ_0000212靶向调控miR-1283的表达

Circular RNA Interactome预测circ_0000212与miR-1283互补的核苷酸序列见图3。WT-circ_0000212与miR-1283共转染的MDA-MB-231细胞荧光素酶活力呈下降态势(P<0.05), 而MUT-circ_0000212与miR-1283共转染的MDA-MB-231细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05), 见表5。

表5 各组的细胞荧光素酶活性测定结果

图3 circ_0000212与miR-1283互补的核苷酸序列

RT-qPCR检测结果显示, miR-1283在pcDNA-circ_0000212组的表达水平低于pcDNA组，差异有统计学意义(P<0.05); miR-1283在si-circ_0000212组的表达水平高于si-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 circ_0000212调控miR-1283的表达

2.5 miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

转染miR-1283后，用RT-qPCR检测miR-1283表达水平，结果显示miR-1283表达水平升高，表明转染成功。然后分别通过CCK-8法及克隆形成实验检测细胞活力及克隆数，流式细胞术及蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡及蛋白表达水平，结果显示, MDA-MB-231细胞活力度降低，细胞克隆活跃度呈下降态势(P<0.05); miR-1283组MDA-MB-231细胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平高于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表7。

A: miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞克隆形成的影响; B: miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞凋亡相关蛋白表达的影响; C: miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞凋亡的影响。图4 miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

表7 miR-1283过表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

2.6 下调miR-1283表达逆转了干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用

RT-qPCR、CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术及蛋白印迹法检测结果显示, si-circ_0000212+anti-miR-1283组miR-1283 水平低于si-circ_0000212+anti-miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05); MDA-MB-231细胞活力度、细胞克隆活力度呈上升态势(P<0.05); si-circ_0000212+anti-miR-1283组MDA-MB-231细胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平低于si-circ_0000212+anti-miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、表8。

表8 下调miR-1283表达逆转了干扰circ_0000212表达对TNBC MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用

3 讨 论

在乳腺癌的治疗中, TNBC颇具挑战性，开发新的TNBC治疗策略已成为临床迫切需要，现阶段靶向治疗为TNBC治疗提供了新思路[10-11]。研究[12]表明, circRNA在疾病中异常表达，可与miRNA相互作用，并对肿瘤的发生发展产生一定影响。有学者[13]在结直肠癌组织发现circ_0000212高表达，通过海绵miR-491调节FOXP4,实现对结直肠癌细胞增殖的促进作用。一项针对胃癌的研究[14]发现, circSFMBT2通过海绵状miR-182-5p促进CREB1表达，诱导胃癌细胞增殖。本研究结果显示，相比癌旁组织, circ_0000121在TNBC组织中呈现更高的表达水平，提示circ_0000121可能会成为TNBC中的癌基因。本研究干扰circ_0000212表达后，发现MDA-MB-231细胞活性衰退，细胞克隆活动减弱，而MDA-MB-231细胞凋亡率增高, cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平呈上升态势。提示干扰circ_0000212表达对MDA-MB-231细胞增殖具有明显抑制作用，并可促进细胞凋亡，进而减缓TNBC的发展进程。

circRNA可充当miRNA海绵，与RNA结合蛋白相互作用，从而发挥重要的生物学功能; 生物学软件预测显示circ_0000212与miR-1283有结合位点。研究[15]报道, miR-1283高表达抑制HTR-8/SVneo细胞的浸润、增殖，促进细胞凋亡。CircGprc5a通过抑制miR-1283的表达和激活YAP1/TEAD1信号通路促进肝癌的发展[16]。本研究结果显示, miR-1283在TNBC组织中的表达水平低于癌旁组织，过表达miR-1283后MDA-MB-231细胞活性降低，细胞克隆形成数减少, MDA-MB-231细胞凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平升高，提示miR-1283过表达对细胞增殖活动产生抑制作用，可促进细胞凋亡。此外，本研究证实了circ_0000212靶向调控miR-1283, 且下调miR-1283逆转了干扰circ_0000212对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用，提示circ_0000212可通过充当miR-1283的海绵分子，负向调节miR-1283表达，从而调控TNBC细胞增殖及凋亡，促进TNBC的发生发展。

综上所述，干扰circ_0000212表达可能通过靶向上调miR-1283，抑制TNBC MDA-MB-231细胞增殖，并促进细胞凋亡。