纳米免疫传感器快速测定乳品中过敏原β-乳球蛋白

闫蓉蓉，李书国

（河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018）

食物过敏已成为一项严重的全球性公共卫生问题，近年来发病率在不断上升[1]。牛乳过敏十分常见， 统计研究表明，我国婴幼儿人群中近3%的人对牛乳过敏[2]。牛乳中有30种以上的蛋白质存在潜在致敏性，其中乳清蛋白和酪蛋白是牛乳中的主要过敏原。而β-乳球蛋白在乳清蛋白中占50%，牛乳总蛋白中占10%，超过80%的牛乳过敏人群对β-乳球蛋白过敏[3]，所以检测食品中的牛乳过敏原具有十分重要的意义。

目前，食品过敏原的检测主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等仪器方法[4,5]，尽管这些方法有着结果准确、灵敏度高的优点，但都存在着操作复杂、价格昂贵、耗时长等不足[6]。作为一种新型生物传感器技术，免疫传感器根据标记与否，又分为标记性免疫传感器与非标记性免疫传感器[7]。标记性免疫传感器即采用某种标记物使免疫反应产生特定的信号，通过检测这些信号定量检测待测物质。非标记性免疫传感器是通过换能器将抗原抗体结合后产生的变化转化成光电信号，记录、处理得到的光电信号即可检测待测物质。与各类仪器方法相比，免疫传感器技术具有检测速度快、成本低廉、操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适用于各类食品基质的检测[8]。

在免疫传感器技术中，关于检测β-乳球蛋白的文献并不多，Eissa等[9]研制出的无标记电化学免疫传感器用于检测牛乳过敏原β-乳球蛋白，检测的线性范围为1 pg/mL～100 ng/mL，检出限为0.85 pg/mL；Ruiz-Valdepenas等[10]建立的夹心型电化学免疫方法，对β-乳球蛋白的线性检测范围为2.8～100 ng/mL，检出限为0.8 ng/mL。本文的创新点在于用一种操作简单、检测迅速的电化学免疫传感器检测β-乳球蛋白，石墨烯-壳聚糖-纳米金复合材料制备简便，由于石墨烯-壳聚糖-纳米金修饰电极检测过敏原的文献较少，因此本文选取了这三种修饰材料。

本文以壳聚糖、石墨烯和纳米金为复合修饰材料固定化β-乳球蛋白抗体制备一种纳米免疫传感器，石墨烯（GS）具有优良的性能与特殊的结构，壳聚糖（CS）具有优秀的生物相容性与成膜性，因此石墨烯和壳聚糖广泛应用于修饰电极领域，然而由于石墨烯材料易发生不可逆团聚，因此具有较低的分散性，将石墨烯与壳聚糖按照合适的比例混合能够使石墨烯更均匀地分散在壳聚糖溶液中，增强电子传递性能，制备的纳米金对探针的氧化还原反应具有催化作用，因此对免疫响应电流具有放大作用，可提高该免疫传感器的灵敏度，以该纳米免疫传感器为基础，建立了一种快速测定乳品中β-乳球蛋白过敏原的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-乳球蛋白（β-LG）标准品，美国Sigma公司；β-乳球蛋白多克隆抗体（1 mg/mL），美国Abcam公司；氯金酸（48%），上海麦克林生化科技有限公司；壳聚糖，北京索莱宝科技技术有限公司；99%石墨烯，北京德科岛金科技有限公司；牛血清白蛋白，上海翊圣生物科技有限公司；对氨基苯甲酸、冰乙酸、柠檬酸三钠，AR，天津市永大化学试剂有限公司；乳清蛋白粉，美国Leprino；水解乳清蛋白粉，TATUA；乳粉，新西兰安佳全脂奶粉。

1.2 仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统，天津兰力科化学电子高技术有限公司；FRESCO21型冷冻离心机，美国赛默飞世尔公司；RHD-S025型恒温磁力搅拌器，德国IKA公司；GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 CS/GS/AuNPs免疫传感器的制备

1.3.1.1 玻碳电极预处理

将玻碳电极（GCE）用超纯水冲洗一遍，采用粒径0.05 μm的氧化铝抛光粉打磨抛光至电极表面光滑，超纯水冲洗电极，再将其依次放置于硝酸溶液（体积分数50%）、丙酮和超纯水中分别超声2 min，氮气吹干备用。

1.3.1.2 免疫传感器的复合修饰材料制备

分别配制1 mg/mL的壳聚糖溶液和1 mg/mL的石墨烯溶液；制备纳米金颗粒（AuNPs）的方法，即把所有玻璃器皿均用王水浸泡过夜，取100 mL 0.01%氯金酸溶液于锥形瓶中，封口膜封口，100 ℃下搅拌加热至沸腾，快速穿破封口膜并加入3 mL 1%的柠檬酸三钠，较短时间内溶液颜色由淡黄色变为酒红色，持续搅拌10 min不变色，移去加热源，待降至室温存于玻璃容器，4 ℃避光保存。

分别移取壳聚糖溶液、石墨烯溶液各1.5 mL，混匀超声10 min。随后加入纳米金溶液3 mL，超声分散处理15 min，制取壳聚糖-石墨烯-纳米金（CS/GS/ AuNPs）悬浮液，于4 ℃保存备用。 1.3.1.3β-乳球蛋白免疫传感器制备

关于检测β-乳球蛋白的免疫传感器制备流程如图1所示。利用三电极系统，以预处理的玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极、铂丝电极为辅助电极。首先进行电聚合处理，在-1.5～0.8 V区间内，以50 mV/s的扫速，在新鲜配制的1 mmol/L对氨基苯甲酸溶液中循环伏安（CV）扫描15圈。冲洗电极晾干，在表面滴加5 μL的1-乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液活化处理1 h，其中EDC为400 mmol/L，NHS浓度为100 mmol/L，现配现用。冲洗晾干，再在其表面滴加5 μL分散均匀的CS/GS/AuNPs修饰液，CS中氨基与玻碳电极表面活化后的羧基发生酸胺缩合反应，可将修饰液固定在电极表面，室温晾干后滴加4 μLβ-乳球蛋白抗体（浓度为10 μg/mL），37 ℃下温育1 h，冲洗后滴加5 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，用于封闭剩余的未反应活性位点，4 ℃下封闭30 min，制得anti-β-LG/CS/GS/AuNPs修饰的电化学免疫传感器，4 ℃下保存备用。

1.3.1.4 电化学分析方法

在本文构建的无标记电化学免疫传感器中，当电极表面滴加修饰液、抗原、抗体以及抗原抗体发生免疫复合反应生成络合物时，电极表面的阻抗、电导率等均会产生变化。传感器会将电极表面发生的电子转移变化转化成可记录的电信号，通过检测这些电信号来标识修饰后的电流变化。

在电化学分析过程中，均采用三电极系统进行，即玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在1.0 mmol/L的K3[Fe(CN)6]+ 0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.0）中反应。针对玻碳电极在修饰以及免疫过程中的电化学特征，应以修饰免疫后的玻碳电极（anti-β- LG/CS/GS/AuNPs/GCE）为工作电极，运用CV法（电压：-0.2～0.6 V，扫描速度：50 mV/s）记录峰值变化。

1.3.2 免疫传感器检测条件优化

1.3.2.1 复合修饰液的配比及用量的筛选

将制备的壳聚糖和石墨烯按照体积比为0.5、1.0和1.5均匀混合为2 mL修饰液，修饰电极采用循环伏安法扫描得到壳聚糖与石墨烯的最佳体积比，随后将壳聚糖石墨烯混合物与纳米金按照0.5、1.0和1.5体积比混合，循环伏安法扫描可得免疫传感器修饰液配比。将修饰液CS/GS/AuNPs按照1、3、5、7、9 μL体积分别滴涂在玻碳电极上，CV扫描记录峰电流响应值。

1.3.2.2 底液pH值的选择

将制备好的免疫传感器在pH值为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的PBS溶液中进行CV扫描测试，记录电流响应值。

1.3.2.3 抗体固定量的筛选

在免疫传感器制备过程中，将β-LG抗体分别以20、30、40、50、60 ng滴涂在电极表面，随后与同一浓度β-LG温育后采用DPV扫描并记录免疫前后的峰电流变化。

1.3.2.4 孵育温度与时间的筛选

抗原抗体分别在温度26、32、37、42 ℃下孵育30 min，运用DPV扫描并记录免疫前后的峰电流值变化。抗原抗体在37 ℃下，分别温育10、20、30、40、50、60 min，DPV扫描并记录免疫前后的峰电流值变化。

1.3.3 标准曲线的建立

将β-乳球蛋白标准品配制为2倍梯度稀释浓度的溶液，并滴涂在制备好的免疫传感器上，得到β-LG/ anti-β-LG/CS/GS/AuNPs电极，37 ℃孵育30 min，通过三电极系统，运用差分脉冲伏安法（DPV，电位：-0.2～0.6 V）测定并记录不同浓度下的β-乳球蛋白峰电流值I。通过分析β-LG免疫前后的峰电流差值（ΔI）与对应质量浓度对数（logCβ-LG）的关系，绘制β-LG免疫传感器的标准曲线，建立线性回归方程。

1.3.4 实际样品的检测

1.3.4.1 样品处理

选取市售乳粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉3种样品进行检测。乳粉预处理方法：取0.5 g样品置于5 mL PBS溶液中，剧烈震荡5 min混匀，在4 ℃冷冻离心机2500 G转速下离心20 min，弃脂肪层，取上清备用。乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉均用PBS配制为25 mg/mL的溶液，振荡5 min充分混匀备用。

1.3.4.2 样品检测方法

将待测样品稀释到最佳检测范围，并吸取5 μL滴涂在制备好的电化学免疫传感器上，置于37 ℃下孵育30 min，采用DPV扫描记录峰电流变化，将测得的峰电流值代入标准曲线，求得待测样品中β-LG浓度。同时用ELISA试剂盒检测，与免疫传感器的检测结果做对比。

1.4 数据处理

以上试验均为3次平行测定并取其平均值，通过SPSS软件开展数据统计分析，利用Origin Pro v8.0软件绘制相关数据图。

2 结果与分析

2.1 免疫传感器的表征

2.1.1 CS/GS/AuNPs修饰电极的电化学表征

通过研究不用修饰材料的玻碳电极在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH=7.0）的测试底液中变化，采用CV法分别对裸GCE（a）、CS/GCE（b）、CS/GS/GCE（c）和CS/GS/AuNPs/GCE（d）进行表征，结果如图2所示。[Fe(CN)6]3-在裸玻碳GCE上出现一对较好的氧化还原峰，当修饰CS后，可明显观察到峰电流减小，表明CS已成功固定在裸GCE表面，并阻碍了电子的转移。当修饰了CS/GS后，发现其氧化还原峰的电流迅速增大，表明通过导电材料修饰后电子更加容易在底液和电极之间转移。利用成膜性较好的壳聚糖溶液分散高比表面积的石墨烯和纳米金[11]，较小的石墨烯粒子和球状形态的纳米金为氧化还原探针提供了更快的电子转移速度和更多的结合位点，增加β-LG抗体在传感器表面的固定量。当再次修饰CS/GS/AuNPs材料后，由于纳米金的大比表面积和高传导性能特点，进一步加快电子传递速率，氧化还原峰电流值达到最大。可依据Randles-Sevcik方程进行计算[12]，电极的电活性面积由公式求出：

式中：

I——阳极峰电流，μA；

D——扩散系数，7.6×10-6cm2/s；

n——参与氧化还原反应的电子数，n=1；

γ——电位变化速率，0.05 V/s；

C——K3Fe(CN)6的浓度，1 mmol/L；

通过计算可得裸GCE电极、CS/GS电极和CS/GS/ AuNPs电极的有效电极面积分别为0.089 cm2、0.136 cm2和0.170 cm2。表明经过石墨烯和纳米金修饰后的电极活性表面面积明显增大，同时也表明纳米金对该修饰电极具有电信号放大作用，使电化学免疫传感器具有更灵敏的检测度。

图3是在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl +0.2 mol/L PBS（pH=7.0）的测试底液中进行得到的交流阻抗图。当电极表面滴涂不同的修饰液后，阻抗值会发生相应的变化。与玻碳电极的阻抗图（曲线a）相比，电极表面滴加CS/GS后（曲线c），阻抗值会变小，说明CS-GS修饰液能够提高电极的导电率；当滴加CS/GS/AuNPs修饰液后（曲线d），电极表面的阻抗值进一步降低，表明CS-GS修饰液与纳米金修饰到了电极表面，能够显著提高电极表面的导电性，促进K3[Fe(CN)6]与电极界面间的电子转移；当β-LG抗体与电极表面结合后（曲线e），由于抗体属于大分子蛋白，在电极表面作用后使电子转移速度降低，因此阻抗值变大。

2.1.2 免疫反应的电化学表征

中国白酒以醇甜、酯香为主要特点，辅以众多的酸类、醛酮类及其他物质，分析原酒中的微量成分可在很大程度上揭示发酵过程中微生物的代谢状况及原酒质量状况[8]。

在制备好的CS/GS/AuNPs/GCE表面滴加8 μLβ-乳球蛋白抗体，孵育一定时间后，通过循环伏安法扫描可明显观察到其氧化还原峰电流相比修饰电极有明显下降，由于抗体属大分子蛋白，电阻率相对较大，阻碍了铁氰化钾分子在电极表面和底液之间的传递，导致电流值下降，同时也表明β-LG抗体固定在了电极表面。随后在其表面再滴加1% BSA溶液封闭电极上剩余的活性位点，最后滴加一定浓度β-乳球蛋白标准品，氧化峰电流值进一步下降，表明抗原抗体发生了特异性免疫结合反应，会进一步增大电子传递较高稳定性阻力。如图4所示。

anti-β-LG/CS/GS/AuNPs/GCE 在 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH为7.0）测试底液和-0.2～0.6 V的电位范围内，进行不同扫描速度（a～h：20～160 mV/s）的循环伏安法处理。由图5可知，免疫传感器的循环伏安氧化还原峰电流随着扫描速率的增大而增大，氧化峰和还原峰的电流值都分别与各自的扫描速度平方根呈现以下线性关系：氧化峰y1=2.0675x+3.4279，线性相关系数R1²=0.9960；还原峰y2=2.24104x+1.86741，线性相关系数R2²=0.9946。由此表明发生在该电极上的反应受扩散过程控制。

2.2 实验条件优化

2.2.1 修饰液的配比及用量的确定

将不同配比的修饰液等体积滴涂电极表面，结果如图6所示，壳聚糖和石墨烯体积比为1:1时，电流最大，随后加入纳米金，体积比为1.0时峰电流也达到最大，当再增加体积比时，峰电流变化缓慢，因此配制修饰液时，选择壳聚糖和石墨烯体积比为1.0，随后纳米金再以体积比1.0加入其余两个的混合液。将制备好的修饰液以不同体积修饰玻碳电极，结果如图6所示，峰电流先快速增大后又基本维持不变，当CS/GS/AuNPs为5 μL时，达到最大峰电流值，表明此时修饰材料最大程度地吸附在电极表面，当再增大修饰量，电极吸附量已经饱和，因此电流值基本保持不变，故选择5 μL作为电极表面修饰量。

2.2.2 不同反应条件对免疫传感器响应电流的影响

2.2.2.1 底液pH值对免疫传感器的影响

底液pH值对免疫传感器检测精确度密切相关，pH值可直接影响吸附在电极表面的β-乳球蛋白抗体的活性，导致检测结果的变化。如图7a所示，随着底液pH值增大，免疫响应电流值先增大后减少，当pH值为7.0时峰电流值达到最大。表明pH值过大过小都抑制了β-乳球蛋白抗体的活性，导致电流值下降，因此选择pH值7.0作为最佳测试底液。

2.2.2.2 抗体固载量对免疫传感器的影响

抗体固载量影响抗原抗体在免疫传感器表面的吸附量进而影响电流响应，β-乳球蛋白抗体分别以20、30、40、50、60 ng质量滴涂在电极表面，DPV扫描结果如图7b所示。增加抗体滴涂量，免疫响应峰电流差值ΔI迅速增大随后逐渐趋于平缓。当固载量较少时，抗原抗体吸附在电极表面的数量较少，同样电子传递阻力也较小，峰电流值较大；当抗体固载量达到40 ng后，抗原抗体完全结合达到饱和，导电能力下降，DPV峰电流差值达到顶峰，当再增加滴涂量其电流响应值变化不大，因此选择40 ng作为β-乳球蛋白最适抗体固载量。

2.2.2.3 孵育温度对免疫传感器的影响

抗原抗体的孵育温度在免疫传感器检测中尤为重要，在一定范围内升高孵育温度可加快抗原抗体充分结合，但温度过高亦可破坏抗体蛋白结构影响DPV峰电流响应。将β-乳球蛋白标准品与免疫传感器在26～48 ℃温育，结果显示免疫前后峰电流变化值ΔI随着温度升高也逐渐增大，这是由于抗原抗体复合物的不断增多导致电子传递阻力增大，造成免疫前后峰电流变化值也变大。如图7c所示，当温度为37 ℃时，ΔI达到最大，随后温度升高ΔI随之减小，这是由于温度过高致使抗体失活，抗原抗体复合物减少，因此选择37 ℃为最佳孵育温度。

2.2.2.4 孵育时间对免疫传感器的影响

免疫传感器的电信号输出也受抗原抗体孵育时间的影响。如图7d所示，随着β-乳球蛋白抗原与抗体免疫反应时间的增加，其免疫前后DPV峰电流差值ΔI也逐渐增大，抗原抗体结合需要一定时间，该过程并没有形成稳定的复合物固定在电极表面。但当孵育时间到达30 min以后，其免疫前后ΔI趋于平缓，表明此时电极表明的抗原抗体已充分反应结合，因此选择30 min为最佳孵育时间。

2.3 β-乳球蛋白标准曲线的建立

用制备好的电化学免疫传感器通过差分脉冲伏安法测定在浓度为0、1、2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的β-乳球蛋白标准品溶液的峰电流值。结果如图8所示，免疫前后的峰电流差值ΔI与β-乳球蛋白质量浓度的对数（logCβ-LG）在2.5 ng/mL～100 ng/mL范围内成正比关系，线性方程为y=5.998x+2.937，R2=0.99064，检出限（S/N=3）为0.75 ng/mL。Boitz等[13]建立了一种UPLC用于检测热处理牛乳样品中的β-乳球蛋白，此方法的线性检测范围为20 μg/mL～560 μg/mL，检出限为7 μg/mL，检测共耗时3 min。Ji等[14]开发和验证了一种基于液相色谱-串联质谱法的方法用于检测食品中的牛奶过敏原，此方法对β-乳球蛋白的线性检测范围为0.48～31.25 μg/mL，检出限为0.20 μg/mL。如表1所示，与其他方法相比，本文制备的免疫传感器具有更低的检测限，可用于牛乳过敏原β-乳球蛋白的痕量检测。

表1 β-乳球蛋白三种检测方法的对比 Table 1 Comparison of three detection methods of β-lactoglobulin

2.4 免疫传感器的稳定性、重现性与特异性

在完全相同的检测条件下，将制备的anti-β-LG/ CS/GS/AuNPs免疫传感器分别扫描5圈、10圈、15圈、20圈，结果如图9a所示，连续扫描20圈，电流响应值仅下降4.01%，同样将制备好的免疫传感器于4 ℃保存，每隔2 d检测其电流值，结果如图9b所示，1周后电流下降率为5.66%，表明制备的免疫传感器拥有较高稳定性。分别制备不同批次的3支免疫传感器并检测同一浓度β-乳球蛋白，记录免疫前后的峰电流变化值ΔI，结果如图9c所示，其平均变化率仅为5.40%，表明该传感器重现性较好。

将免疫传感器与3种非特异性蛋白BSA、α-LA和Casein孵育，与特异性蛋白β-乳球蛋白对照，其中β-乳球蛋白浓度为100 ng/mL，其余3种为1000 ng/mL，采用差分脉冲伏安法扫描测得免疫前后峰电流差值ΔI，结果如图9d，BSA、α-LA和Casein免疫前后的峰电流变化远小于β-乳球蛋白，因此表明该免疫传感器的特异性较好。

2.5 样品检测及其加标回收实验

经过1.3.4处理后的3种样品，在免疫传感器的最优检测条件下进行DPV扫描，记录对应的免疫前后峰电流差值，代入线性回归方程计算待测样品中β-乳球蛋白的浓度。此外再向3种样品中分别加入不同浓度β-乳球蛋白标准品进行加标回收实验，平行试验3次，按照公式计算，同时也采用ELISA法测定比对，结果见表2。

由表2测定结果和加标回收率可知，采用免疫传感器测定3种样品的回收率都在88.59%～97.64%之间，相对偏差在2.47%～6.06%范围内，与ELISA法比较，两者结果基本一致，表明该方法可以用于实际样品检测。由此可得，相比于其他分析方法，本法建立的电化学免疫传感器检测β-乳球蛋白具有较高的灵敏度。

表2 样品中β-LG的测定结果及其加标回收率 Table 2 β-LG determination results in the samples and its spike-and-recovery experience

3 结论

本文制备了一种用于检测β-乳球蛋白的高灵敏度的无标记电流型免疫传感器，针对构建的β-乳球蛋白免疫传感器进行电化学行为表征，并优化了其试验条件。结果表明，该纳米免疫传感器在2.5～100 ng/mL范围内，免疫响应电流值与β-乳球蛋白质量浓度的对数成正比关系，其检出限为0.75 ng/mL，具有较高的灵敏度和良好的稳定性、重现性和特异性。在实际乳品样品检测中，该法的加标回收率位于88.59%～ 97.64%之间，回收率较好，经ELISA验证，结果基本一致，因此该法可用于乳制品中β-乳球蛋白抗原的快速检测。