超高效合相色谱法分离和测定氟苯尼考对映体

张文华，王英，侯建波，陶红霞，胡起立，王良莉，谢文，徐敦明

（1.杭州海关技术中心，浙江杭州 310016）（2.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江杭州 310016） （3.厦门海关技术中心，福建厦门 361026）

氟苯尼考（Florfenicol，FF）又称氟甲砜霉素，化学名称为2,2-二氯-N-[(1R,2S)-3-氟-1-羟基-1-(4-甲基磺酰基苯基)-2-丙基]乙酰胺，是一种常用的兽用抗生素[1]，抑菌效果好、抗菌谱广、安全高效，常用于防治畜禽消化道和呼吸道细菌性感染病[2]。氟苯尼考结构中存在两个对映体：(-)-氟苯尼考（左旋体）、(+)-氟苯尼考（右旋体）（图1）。研究发现，氟苯尼考外消旋体中不同结果对映体之间的生物活性差异较大，其中含有抗菌活性的对映体为(-)-氟苯尼考（左旋体），无抗菌活性的对映体为(+)-氟苯尼考（右旋体），氟苯尼考中左旋体的含量决定了氟苯尼考药效的高低[3,4]。

氟苯尼考的检测方法一般有酶联免疫吸附法（ELISA）[5]、分光光度法[6]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[7,8]、高效液相色谱法（HPLC）[9,10]等，主要测定氟苯尼考外消旋体，未检测其对映体，因而无法准确测定氟苯尼考产品中活性成分左旋体的含量，不利于对药品质量和药效的监控。高效液相色谱法[3,4,11,12]为国内外检测氟苯尼考对映体的主要方法，该方法分离效果好，但有机试剂使用量大，检测时间长。超高效合相色谱技术（UPC2）作为一种新型高效的色谱分离技术受到了广泛的关注，该技术的主体流动相为超临界状态CO2，可通过调整系统背压、色谱柱温度及有机溶剂的比例，使流动相的密度和极性发生改变，从而达到精密控制目标物分离效果的目的[13]，在手性分离的应用中具有明显优势[14-17]。目前，UPC2技术应用于氟苯尼考对映体的分离及含量测定未见有报道。

本研究建立了一种超高效合相色谱法快速分离和测定氟苯尼考对映体的方法。本实验优化了氟苯尼考对映体的色谱分离条件，考察了两种氟苯尼考对映体标准品的稳定性，并对市售的常见氟苯尼考外消旋体标准品进行了分离及测定。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

Waters超高效合相色谱仪（配有PDA检测器），美国Waters公司，；JJ500电子天平，美国双杰天平公司；AE260电子天平，瑞士Mettler公司；Synergy185超纯水仪，美国Millipore公司；N-1210BV旋转蒸发仪，日本东京理化公司；N-EVAPTM111氮吹仪，日本东京理化公司；WH-861涡旋混匀器，太仓市华利达实验设备有限公司。

异丙醇、乙醇、甲醇、正庚烷、乙腈、甲酸（色谱纯），德国Merck公司；氨水（分析纯），莱阳市康德化工有限公司；CO2（99.999%）；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。

手性分离色谱柱：Acquity Trefoil AMY1 [150 mm×3.0 mm，2.5 µm，填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、Acquity Trefoil CEL1 [150 mm×3.0 mm，2.5 µm，纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、Acquity Trefoil CEL2 [150 mm×3.0 mm，2.5 µm，填料为纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)]，美国Waters公司。

氟苯尼考对映体标准品：(-)、(+)-氟苯尼考（纯度>99.0%，中国牧工商总公司研究院）。测试样品来源于3个不同厂家，样品均用甲醇超声溶解，以20%（V/V）异丙醇正庚烷混合溶液稀释至相应浓度。

1.2 标准储备液及工作液的配制

1.2.1 外消旋体标准储备液

准确称取各氟苯尼考外消旋体标准品0.01 g（精确至0.1 mg），用甲醇准确定容至10 mL容量瓶中，配制成1.00 g/L的标准储备液，-18 ℃保存30 d。

氟苯尼考外消旋体的标准中间溶液：准确吸取一定量的外消旋体标准储备液，用正庚烷稀释至10.00 mg/L的标准中间溶液，-18 ℃保存14 d。

1.2.2 对映体标准储备液

分别准确称取(-)、(+)-氟苯尼考标准品0.01 g（精确至0.1 mg），用甲醇准确定容至10 mL容量瓶中，配制成1.00 g/L的标准储备液，-18 ℃保存30 d。

两种氟苯尼考对映体的混合标准工作溶液：分别准确移取(-)、(+)-氟苯尼考标准储备溶液，用正庚烷溶液配制成4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、400.00 mg/L的系列标准工作溶液，-18 ℃保存14 d。

1.3 色谱条件

色谱柱：Acquity Trefoil CEL2（150 mm×3.0 mm，2.5 µm）；流动相A为CO2，助溶剂B为甲醇；采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～2 min（10% B），2.0～3.0 min（10%～20% B），3.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～10% B），6.1～8.0 min（10% B）；系统背压17.2 MPa；检测波长224 nm；流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量5.0 µL。

1.4 梯度分离条件

A为CO2，B为甲醇：

梯度分离条件1：0～8.0 min（15% B）；

梯度分离条件2：0～2.0 min（10% B），2.0～3.0 min（10%～20% B），3.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～10% B），6.1～8.0 min（10% B）；

梯度分离条件3：0～3.0 min（12% B），3.0～4.0 min（12%～20% B），4.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～12% B），6.1～8.0 min（12% B）。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

经过UPC2二极管检测器（PDA）扫描后，在色谱图中所提取氟苯尼考罗对映体的紫外光谱图。结果表明，在202、224、265 nm处出现了较强的吸收峰（图2），其中最强的吸收波长为224 nm，灵敏度相对较高，氟苯尼考对映体出峰处干扰峰较少。综合考虑，对氟苯尼考药品检测而言，用杂质较少且吸光度较高的224 nm波长检测更具有优势，故本实验选择224 nm作为检测波长。

2.2 色谱柱的优化

本研究中分离的两种氟苯尼考对映体，因结构相似度高，较难分离。因此，选择沃特世3种相同规格且适用于手性分离的色谱柱CEL2、AMY1、CEL1，来考察不同色谱柱对两种氟苯尼考对映体的分离效果。移取3份10.0 mg/L氟苯尼考对映体的系列标准工作溶液0.50 mL至3个进样小瓶中，采用上述色谱条件进行检测。

结果表明，采用AMY1和CEL1手性色谱柱分离时，在色谱图上只出现1个色谱峰，说明两种氟苯尼考对映体在这两款手性色谱柱上无法实现分离；而采用CEL2手性色谱柱分离时，两种氟苯尼考分离度和色谱峰形良好（图3）。ACQUITY UPC2Trefoil色谱柱是基于改性的多聚糖型固定相，能提供广泛的手性选择性。Trefoil CEL2、AMY1和CEL1键合相不同，选择性彼此互补，为手性化合物的分离提供不同的保留特性。多糖类纤维素CEL2手性柱固定相具有高度有序的结构，能形成许多手性的空腔，其拆分机理为氟苯尼考对映体的官能团与固定相上的手性空腔相互作用，通过“三点作用”方式[18]进行手性识别，两个对映体与固定相的作用力有差异，使得保留时间不同。由于(-)-氟苯尼考对映体分子中的空间构型与CEL2手性固定相分子中的位阻基团之间产生了强烈的位阻作用，阻碍了手性识别所需的分子间作用力的形成，减弱了其在手性固定相上的有效吸附，故(-)-氟苯尼考对映体分子被流动相优先洗脱而先出峰；而(+)-氟苯尼考对映体分子的空间构型无明显的位阻效应，对映体分子中的羟基易与固定相的酯基形成氢键作用力，从而有利于“三点作用”的形成，在色谱柱上不易被洗脱，保留时间延长，后出峰。因此本实验选择CEL2色谱柱作为氟苯尼考的手性分离柱。

2.3 梯度分离条件的优化

为了获取最佳的梯度分离条件，实验选择流动相为CO2（A）-甲醇（B），考察了“1.4”节中不同梯度分离条件对两种氟苯尼考对映体分离效果的影响。由图4可见，相比梯度1的分离条件，采用梯度2和梯度3的分离条件，两种氟苯尼考对映体的色谱峰形更尖锐，但梯度2的分离度更好，达到1.68，故本实验采用梯度条件2。

2.4 流动相中助溶剂的选择

超高效合相色谱仪的有机溶剂使用量少，主要采用超临界CO2作为流动相，通过在助溶剂中加入少量有机溶剂来加强对目标产物的洗脱能力和选择性。实验考察了甲醇、0.5%（V/V）甲酸甲醇溶液、0.5%（V/V）氨水甲醇溶液等不同助溶剂对两种氟苯尼考对映体分离的影响。如图5所示，当采用0.5%（V/V）甲酸甲醇溶液作为助溶剂时，色谱图基线抬高，未出现目标峰；当采用0.5%（V/V）氨水甲醇溶液和甲醇作为助溶剂时，目标物的色谱峰的峰形尖锐，且甲醇作为助溶剂时，两种氟苯尼考对映体的分离度更好，达到1.69。因此，本实验室选择甲醇作为助溶剂。

2.5 系统背压的优化

UPC2采用超临界状态的CO2作为流动相，实验过程中通过控制系统背压可有效改变流动相的粘度和密度，从而调节流动相的溶解能力和洗脱能力。流动相的粘度和密度会随着系统背压的升高而增加。由于CO2的压力超过7.38 MPa且温度超过31 ℃以上，CO2才会进入超临界状态。因此本实验以甲醇作为助溶剂，在柱温40 ℃条件下，考察了10.3、13.8、17.2、20.7、24.1 MPa 4种系统背压对目标物峰形和分离度的影响。当实验逐渐提高系统背压，目标物的保留时间提前，峰形变得更尖锐（图6）。4种条件下，两种氟苯尼考对映体在系统背压17.2 MPa时色谱峰形和分离度均达到最佳。综合考虑色谱峰形、分离度及系统压力，最终选择17.2 MPa为最佳系统背压。

2.6 色谱柱温的优化

在UPC2系统中，色谱柱温度主要通过影响超临界状态CO2流动相的密度来影响对目标物的分离效果。实验升高色谱柱温度，流动相的粘度逐渐降低，密度减小，对目标产物的洗脱能力也随之减弱，保留时间延长。鉴于Acquity Trefoil CEL2手性色谱柱的运行最高温度为40 ℃，CO2的温度大于31 ℃且压力高于7.38 MPa，CO2才会进入超临界CO2状态。因此本实验考察了色谱柱温在31～40 ℃范围内对目标化合物色谱峰形和分离度的影响。结果表明，随着温度的升高，两种氟苯尼考对映体的保留时间逐渐增加（图7）。当柱温为31 ℃时，色谱图基线不平，两种氟苯尼考对映体的分离度为1.2；当色谱柱温为35 ℃和40 ℃时，两种氟苯尼考对映体的分离度分别为1.70和1.69，在6.0 min内实现良好的基线分离。相比35 ℃，在40 ℃的柱温条件下，色谱峰更尖锐。因此，最终选择色谱柱温度为40 ℃。

2.7 定容试剂的优化

在样品测定的过程中，定容试剂的选择会对目标化合物色谱峰的灵敏度和峰形产生较大的影响。因此 本实验考察5种常用定容试剂甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷对氟苯尼考对映体色谱峰形的影响（图8）。结果表明，当用乙醇和乙腈作为定容试剂时，两个氟苯尼考色谱峰未完全分离，峰形较差；当用甲醇、异丙醇和正庚烷作为定容试剂时，两种氟苯尼考对映体的色谱峰均在6.0 min内实现了完全分离，但相比甲醇、异丙醇3种定容试剂，正庚烷作为定容试剂时，目标物的色谱峰形变得尖锐，且分离度为1.65。因此，本实验选择正庚烷作为定容试剂。

2.8 标准溶液的稳定性

化合物的稳定性是保障整个实验检测结果准确的前提，因此本文以新配制氟苯尼考对映体标准溶液为基准，计算储存不同时间的氟苯尼考对映体的含量，来考察氟苯尼考对映体标准溶液的稳定性。分别精确移取1.00 mL的10.00 mg/L氟苯尼考对映体的混合标准工作溶液于7个1.5 mL UPC2专用进样小瓶中，上机进行含量测定，检测完成后再转移至7个密封性良好的进样小瓶中，并用封口膜封好后于-18 ℃下保存放置。按照上述优化后的色谱条件测定新配制的与分别储存1、3、5、7、14、30、60 d的氟苯尼考对映体标准溶液，14 d内(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考含量的相对标准偏差（RSD）分别为4.0%、2.1%，30 d内(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考含量的RSD分别为10.2%、12.1%。采用T检验法比较新配制与储存不同天数的氟苯尼考对映体含量是否存在显著性差异。结果表明，两种氟苯尼考对映体-18 ℃下放置14 d时p>0.05，在统计学上无显著性差异，表现良好的稳定性；-18 ℃下放置30 d时p<0.05，说明两种氟苯尼考对映体在30 d时具有显著性差异。因此，两种氟苯尼考对映体标准溶液在-18 ℃条件下可保存14 d。

2.9 方法学考察

2.9.1 线性范围和灵敏度

选择“1.2.2节”中的4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、400.00 mg/L的氟苯尼考对映体系列标准工作溶液，按照优化后的色谱条件进行测定，以对应峰面积为纵坐标（Y），标准溶液的质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，如表1所示。同时以3倍信噪比计算仪器的检出限（LOD，S/N=3），结果表明，两种氟苯尼考对映体的仪器检出限（LOD）为2.00 mg/L，在表1所列的线性范围内，线性良好，相关系数（r2）均大于0.9993。

表1 各个化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限 Table 1 Linear range, linear equation, correlation coefficient (r2) and limit of detection (LOD) of each compound

2.9.2 精密度

在优化后的色谱条件下，“1.2.2”中的10.0 mg/L系列标准工作溶液，连续进样6次上机测定，记录两种目标化合物的色谱峰面积，计算各物质对应峰面积的RSD，分别为0.65%和0.81%，表明该方法的精密度良好，符合GB/T 32465-2015[19]的要求，能够满足氟苯尼考对映体的分离和测定要求。

2.10 方法的应用

在优化的条件下，应用本方法分别测定3份市售常见氟苯尼考粉中(-)、(+)-氟苯尼考的含量，采用“2.9.1”所绘制的标准曲线以外标定量法计算氟苯尼考粉中(-)、(+)氟苯尼考对映体的含量。结果表明，3份氟苯尼考粉中均未检出(+)-氟苯尼考，均只检出(-)-氟苯尼考，含量达到标签值的80%以上，样品纯度与文献[3,11]报道采用HPLC法测试氟苯尼考样品的纯度相符。但目前文献[3,4,11]所报道HPLC方法的检测时长达到10 min以上，而本方法在6.0 min内完成了两个氟苯尼考对映体的分离及含量测定，相比而言，本方法的检测时间更短，分离度更高、有机试剂使用量更少。

3 结论

本文采用UPC2对氟苯尼考对映体进行分离，考察了氟苯尼考检测波长和储存稳定性，同时还考察了手性色谱柱、梯度分离条件、助溶剂、系统背压、柱温、定容试剂对氟苯尼考对映体分离的影响。最佳色谱条件为：手性色谱柱Acquity Trefoil CEL2（150 mm×3.0 mm，2.5 µm），助溶剂甲醇，流速1.0 mL/min，检测波长224 nm，柱温40 ℃，系统背压17.2 MPa。在6.0 min内可实现两种氟苯尼考对映体的分离。该方法分离效果好、检测时间短、稳定性良好，为氟苯尼考对映体的精确测定提供了一种新方法。