阴道菌群中粪肠球菌对阴道加德纳菌、阴道阿托波菌和两种菌混合生长的生物膜影响的体外研究

冯旸子，孙 茜，张晓宇，白会会，何渊慧，杜梦瑶，范琳媛，刘朝晖*

(1.首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇科，北京 100026；2.首都医科大学，北京 100069；3.首都医科大学附属北京同仁医院妇科，北京 100730)

细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)是育龄期妇女常见的下生殖道感染性疾病，厌氧菌和BV相关微生物(BV-associated bacteria,BVAB)过度繁殖(如阴道加德纳菌、阴道阿托波菌等)导致菌群失调而引起。由于该病的复杂多微生物特质，BV的抗菌药物常规治疗有效率仅60%，复发率高达30%～40%[1]。近期研究认为，BV复发与细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)的形成密切相关。尽管BV的病因学尚存在争议，但多项研究认为阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis,GV)是BV的早期定殖者，而阴道阿托波菌(Atopobium vagina,AV)是常见的与加德纳菌相关的微生物之一。阴道内益生菌乳杆菌对于BV的抑制作用已有很多研究，而阴道内的另一种常见微生物粪肠球菌对于BV的研究很少。多项人体研究中,粪肠球菌都被作为益生菌抑制病原菌的生长、生物膜形成和毒素产生。为了更好地模拟阴道内BV复杂的多菌环境，通过用加德纳菌与阿托波菌共培养来代替单菌，并研究了阴道内粪肠球菌对BV相关微生物形成的生物膜的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源及诊断标准 粪肠球菌采用标准菌株(ATCC-29212)；阴道来源加德纳菌、阿托波菌，采用Nugent革兰染色评分法作为诊断标准，在首都医科大学妇产医院从初次临床诊断为BV患者的阴道分泌物标本中分离纯化，使用16sDNA PCR扩增并鉴定证实。

1.1.2 试剂 牛脑心浸液基础培养基、葡萄糖粉剂、可溶性淀粉、MRS培养基均购自solarbio life science；PBS缓冲液购自Beijing Four-Ring Sunny Bioscience Co.LTD；结晶紫购自Beijing Solarbio Science & Technology Co.LTD；95%酒精购自天津市华东试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 不同比例阴道加德纳菌和阴道阿托波菌的共培养情况 将复苏和传代培养的加德纳菌和阿托波菌挑取单菌落，接种到改良BHI液。将加德纳菌用麦氏比浊仪调制为0.5麦氏单位菌悬液1.5×108(CFU)/mL，将阿托波菌调制为0.5麦氏单位菌悬液，1∶1000稀释达到1.5×105(CFU)/mL。用倍比稀释法将加德纳菌与阿托波菌的比例分别调为1000∶1，500∶1，250∶1，125∶1，62.5∶1，31∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1。37℃、5%CO2静置培养。

1.2.2 不同比例阴道加德纳菌和阴道阿托波菌共培养的生物膜形成测定 分别在24、48、72h时将菌液吸出，PBS漂洗2次，室温干燥；加0.2%结晶紫染色30min，PBS漂洗3次，室温干燥；加95%酒精200μL脱色5min，将液体移到原96孔板右半部分，使用酶标仪580nm波长检测洗脱液的OD值。以空白对照组OD值的平均数加3倍标准差值为临界值(ODc)，待检测微孔内OD580值4 ODc分别代表形成生物膜能力为无、弱、中和强。

1.2.3 同等菌量的阴道加德纳菌单独培养、阴道阿托波菌单独培养、加德纳菌和阿托波菌1∶1共培养 将传代培养的加德纳菌和阿托波菌挑取单菌落，接种到改良BHI液，将菌浓度用麦氏比浊仪调至0.5麦氏单位，再将0.5麦氏浓度的对数生长期菌悬液(1.5×108CFU/mL)进行1∶15稀释达到1×107CFU/mL。将调整好的加德纳菌悬液100μL/孔、阿托波菌悬液100μL/孔、50μL加德纳菌与50μL阿托波菌/孔置于96孔板，同时加无菌盐水100μL/孔、sBHI 100μL/孔作为实验组，用sBHI 100μL/孔加无菌盐水100μL/孔、sBHI 100μL/孔作为对照组，37℃、5%CO2静置培养。50μL加德纳菌与50μL阿托波菌1∶1共培养时与单独100μL加德纳菌或100μL阿托波菌菌量相同，因此形成的生物膜量有可比性。生物膜形成测定方法同上。

1.2.4 制备含有粪肠球菌代谢产物的上清 将粪肠球菌传代培养后3000r/min离心10min，取上清，经0.45μm孔径的滤器过滤，收集滤液即为含有粪肠球菌代谢产物的上清液。

1.2.5 加含粪肠球菌代谢产物的上清液后同等菌量的阴道加德纳菌单独培养、加德纳菌和阿托波菌1∶1共培养 将调整好的加德纳菌悬液100μL/孔、阿托波菌悬液100μL/孔、50μL加德纳菌与50μL阿托波菌/孔置于96孔板中，同时加含粪肠球菌代谢产物的上清液作为实验组，用sBHI 100μL/孔加含粪肠球菌代谢产物的上清液作为对照组，37℃、5% CO2静置培养。生物膜形成测定方法同上。

2 结 果

2.1 不同比例阴道加德纳菌和阴道阿托波菌共培养的生物膜形成情况 加德纳菌与阿托波菌的比例为1000∶1，500∶1，250∶1，125∶1，62.5∶1，31∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1时，未得出较为明显的两菌比例与生物膜形成量的线性关系。因此借鉴其他文献的实验方法，用加德纳菌：阿托波菌为1∶1共培养初步探索。

2.2 同等菌量的阴道加德纳菌单独培养、阴道阿托波菌单独培养及加德纳菌和阿托波菌1∶1共培养的生长情况及生物膜成膜情况 同等菌量的加德纳菌单独培养、阿托波菌单独培养及加德纳菌和阿托波菌共培养的生长曲线见图1。

图1 相同菌量的加德纳菌、阿托波菌单独培养及加德纳菌和阿托波菌1∶1共培养的生长曲线

阿托波菌几乎不形成生物膜，50μL加德纳菌和50μL阿托波菌共培养时形成的生物膜与同等菌量的100μL加德纳菌单独培养形成的生物膜无显著差异(P>0.05)。见图2。

图2 不同培养时间生物膜形成情况

2.3 含粪肠球菌代谢产物的上清液对加德纳菌和阿托波菌1∶1共培养的成膜情况影响 含粪肠球菌代谢产物的上清对阴道加德纳菌单独培养和加德纳菌与阿托波菌共培养的生物膜形成均有显著抑制(P<0.05)。见表1。

表1 不同组别生物膜形成情况(OD580nm)

3 讨 论

3.1 BV的发生可能与阴道加德纳菌、阴道阿托波菌等多菌种相互协作有关 在正常健康女性的阴道环境中有多种细菌存在，但这种菌群之间存在一种相互依赖和相互制约的生态平衡，一般不会致病。而BV时阴道内的微生态平衡紊乱，乳杆菌数量减少，厌氧菌和BV相关微生物过盛繁殖(如阴道加德纳菌、阴道阿托波菌、羞怯动弯杆菌、普雷沃菌、具核梭杆菌、解脲支原体等)导致菌群失调。众多厌氧菌相互扶持，继而造成复杂混乱、难以修复、易反复的BV结局。多项研究认为,BV中加德纳菌和阿托波菌之间可能存在协同作用[2]。因此，本研究选择加德纳菌和阿托波菌模拟BV的真实状态。

BV复发与细菌生物膜的形成密切相关。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境的变化而附着于无机材料或有机体的表面，由多糖、纤维蛋白等胞间基质将微生物自身包绕其中而形成的膜状结构。细菌在形成生物膜后，由于致密的胞间基质将细菌包被其中，人体宿主免疫系统不能有效清除病原，抗菌药物也很难将其完全灭活，细菌表现出更强的耐药性，易形成持续性的感染[3]。BV的生物膜是由加德纳菌作为最初定植者，通过“抢先占领”的方式先黏附于阴道黏膜细胞表面，黏附性能差的细菌随后黏附，最终在宿主细胞表面形成牢固的多菌生物膜，成为诱发BV的持续感染源[4-6]。因此，阴道加德纳菌对BV的发生发展有重要作用。在BV患者的阴道标本中，超过90%的上皮表面存在生物膜，加德纳菌是其重要组成部分。生物膜底部主要由加德纳菌组成，次要的BV相关菌种较少见。从生物膜的底部到顶部，加德纳菌的数量逐渐下降，在33%的生物膜顶部无加德纳菌的存在[4]。加德纳菌有显著高于其他BV相关厌氧菌的初始黏附力、毒力潜能和细胞毒性效应[4]。加德纳菌还可通过释放细胞溶解素(vaginolysin，VLY)诱导阴道生物膜裂解，释放唾液酸酶(sialidase,SLD)破坏阴道上皮细胞的保护性黏液层[4]。唾液酸酶被认为是BV免疫抑制、免疫逃逸和复发的核心[7]。此外，加德纳菌生物膜与浮游细胞相比，对过氧化氢和乳酸表现出更高的耐受性。生物膜增加了对乳酸菌的抵抗力，为细菌的生长提供了有利条件[8]。

阿托波菌是常见的与加德纳菌相关的微生物之一，与BV患者的阴道分泌物增多、阴道pH升高和线索细胞的存在呈正相关，与晚期流产和早产也有一定的关系[2]。在BV的生物膜组成中，加德纳菌占60%以上，阿托波菌占近40%[2]。但与加德纳菌不同的是，阿托波菌很少作为健康女性的阴道菌群的一部分，被认为是更有特异性的BV标志物。在健康女性的阴道菌群中，60%可检测到加德纳菌，仅12%可检测到阿托波菌；而在BV患者的阴道菌群中，99%可检测到加德纳菌，96%可检测到阿托波菌。可见阿托波菌对BV的特异性较加德纳菌更高。此外，81%存在阿托波菌的女性可出现复发性BV，89%可出现复发性菌群异常；64%存在加德纳菌的女性可出现复发性BV，73%可出现复发性菌群异常。当加德纳菌和阿托波菌同时出现时，患者的Nugent评分较高，且BV复发率(83%)显著高于仅存在加德纳菌的患者(38%)[9]。

阴道微生物群有动态性和复杂性的特点，多种微生物都可能对BV的发生发展有影响，这对我们构建真实的多微生物体外生物膜模型有很大的挑战。目前，大多数体外研究仅涉及单种生物膜，且主要为加德纳菌。本研究构建了一个由加德纳菌和阿托波菌两种高度相关的BV相关微生物组成的体外生物膜，以更好地模拟BV的真实状态。

本研究发现，加德纳菌单独培养24、48、72h时生物膜形成较好，而阿托波菌单独培养时几乎不形成生物膜。但用同等菌量的加德纳菌和阿托波菌共培养时，形成的生物膜与加德纳菌单独培养没有显著差异。表明两种菌可能存在协同作用，但作用机制尚未清楚。研究表明，加德纳菌与阿托波菌的协同作用机制可能有以下几点：(1)加德纳菌和阿托波菌共培养时增强了其与阴道上皮细胞共聚集的能力。(2)在浮游生物单独培养时，92%的阿托波菌在生长48h后失去了其活性，但与加德纳菌共培养时可一直保持其活性。(3)共培养时有更高的促炎因子水平，有更强的耐药性，与加德纳菌毒力相关的基因表达也显著上调。如HMPREF0424-0821基因，可编码一个糖基转移酶，是生物膜维持所需的关键酶，在加德纳菌、阿托波菌和普雷沃菌共培养时显著上调[4,10]。(4)高浓度的加德纳菌与阿托波菌共培养可消耗更多的氧气，从而创造一个对革兰氏阴性厌氧菌更有利的环境[11]。

3.2 阴道来源的粪肠球菌可能通过产生乳酸协助乳杆菌辅助BV治疗 粪肠球菌作为乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)中的一员，被广泛应用于食品发酵中。以往研究中，人们往往对产乳酸的杆菌较重视，而忽视了产乳酸的球菌的作用。球菌也可产生乳酸、细菌素、过氧化氢等代谢产物，并有选择性的抑菌作用。肠球菌是一种机会性病原体，能在免疫力低下的人群中引起感染。且肠球菌有多种毒力因子，对多种抗生素有耐药性。因此肠球菌作为益生菌用来开发新的药品仍存在争议。但研究表明，粪肠球菌虽然不是健康女性常见的阴道优势菌，但可在健康女性阴道中存在且不致病。84例通过革兰染色、分泌物湿片镜检、Nugent评分和细菌真菌培养诊断为健康女性的阴道后穹窿和子宫颈外口拭子中，16例(11.1%)的优势菌为肠球菌[12]。一项对97例BV患者的研究表明,多种细菌与BV复发呈正相关，包括斯尼斯菌、巨球形菌、普雷沃菌、阿托波菌、加德纳菌等，表明各种阴道细菌间有相当复杂的协同作用，可能有助于其持续存在。而乳杆菌和肠球菌与BV复发呈负相关。乳杆菌已在多项研究中证明与BV的治疗结果显著相关，并对多种BV相关微生物有抑制作用，是维持阴道健康的关键菌。此项实验结果表明，在丰度、复发关联和细菌间相互作用等方面，肠球菌的表现都与乳杆菌极其相似。甲硝唑治愈组中，治疗前和第7d肠球菌的比例与复发组相似，但在第30d肠球菌的比例在10%左右，复发组则几乎无肠球菌。可见良好的预后与肠球菌的增加有关。治愈组中，第7d和第30d时，40例患者的阴道菌群中大部分为乳杆菌(>50%)，肠球菌占小部分(<5%)。15例患者的阴道菌群中有大量肠球菌(>30%)，乳杆菌很少(<5%)。可见肠球菌可抑制其他细菌的生长，可能与产生乳酸有关，这对于体内无足够水平的乳杆菌而无法产生高水平乳酸的患者至关重要[13]。此外，粪肠球菌的代谢产物包括有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，在多项研究中都可抑制病原菌的生长、生物膜形成和毒素产生。研究表明，粪肠球菌产生的肠球菌素对肺炎克雷伯菌分离株有显著的抗菌活性，且肠球菌素的抗生物膜活性强于对克雷伯菌最有效的抗菌药物——阿米卡星。粪肠球菌还可抑制金黄色葡萄球菌的生长，可改变其产肠毒素的能力及其特定基因表达[14]。此外，粪肠球菌发酵上清可有效抑制多种致病菌，如单核增生李斯特菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌和鼠伤寒沙门氏菌等的生长，抑菌效果较好。其机制可能是肠球菌素作用于细胞膜并在膜上形成孔隙，从而导致细胞内成分泄露，破坏跨膜电位和pH梯度[15]。粪肠球菌已在多项对照实验中被用于改善人类健康，包括可减少抗生素相关腹泻的发生率、缓解肠易激综合征、治疗上呼吸道的复发性疾病、缓解鼻咽癌放化疗后口腔黏膜炎、降低胆固醇水平、提高重症颅脑损伤患者的免疫功能等。肠球菌发酵过程中产生的生物活性肽已被证明可通过抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)的活性发挥抗高血压作用，可减少高血压的风险因素并缓解症状。虽然与卡托普利等血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)药物相比，肠球菌衍生的ACE抑制剂在体外的活性较低，但无干咳和血管性水肿等药物副作用。肠球菌的发酵液还有免疫调节、抗炎、抗氧化等活性，对α-葡萄糖苷有抑制作用，发挥其抗高血糖活性[16]。粪肠球菌含多种毒力因子，但毒力因子的存在并不能明确推断出这些菌株会导致疾病。且粪肠球菌对多种常见抗生素表现敏感。本研究发现，粪肠球菌标准株传代培养后离心的上清液对加德纳菌和加德纳菌与阿托波菌共培养的生物膜形成有显著抑制作用。这可能与粪肠球菌的代谢产物中存在乳酸、肠球菌素、过氧化氢、生物活性肽等物质可以协助乳杆菌抑制其他厌氧菌的生长和成膜有关，具体发挥抑制作用的成分还需进一步实验证明。

本研究在体外用加德纳菌与阿托波菌共培养来代替单菌，更好地模拟了阴道内真实的BV环境，结果显示阴道内粪肠球菌对BV相关微生物形成的生物膜有抑制作用，今后需体内实验研究等来进一步深入研究BV相关问题。