单细胞测序技术在妇科恶性肿瘤中的研究进展

朱昕芸，李春波，华克勤

(复旦大学附属妇产科医院，上海 200000)

宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌是临床常见的妇科三大恶性肿瘤，也是女性最主要的死亡原因。据估计，在2020年，全球新增病例约130万，其中有50%死亡。宫颈癌最常见，且发病有年轻化的趋势。近些年，随着宫颈癌筛查意识的提高和HPV疫苗的推广应用，宫颈癌的发病率明显降低，但在我国及广大发展中国家比例仍较高。子宫内膜癌发生率仅次于宫颈癌，近年来，由于高脂高热饮食和低运动量生活方式的影响，子宫内膜癌在我国的发病率呈上升趋势。卵巢癌发生率虽不如前两者，但死亡率却高居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌早期诊断困难，大多数患者在Ⅲ～Ⅳ期才被确诊，患者的5年生存率约为30%。为了更深层次地理解肿瘤的生物学特点，传统的转录组测序以组织作为研究对象，研究结果是一个细胞群体的平均基因表达量，在各亚群的所有细胞中测量mRNA水平，难以描述细胞间的异质性[1]。近些年，随着单细胞测序技术的发展，可有效解决这一问题。与反映基因突变和平均表达水平的传统批量RNA测序相比，scRNA-seq(single-cell RNA sequencing)测量的是单个细胞的多组学特征，这些scRNA-seq数据为肿瘤分子分型和精确治疗提供支持证据[2]。本文就单细胞测序在妇科恶性肿瘤中的研究进展予以综述,旨在探寻该技术在妇科恶性肿瘤的基础研究及诊治方面可能带来的重要变革。

1 单细胞测序技术概述

单细胞测序技术是通过将组织或体液中的细胞群分离成单个细胞并对其遗传物质进行高通量测序分析的技术手段[3]。与传统的组织测序不同，单细胞测序是将单个细胞中的核酸(DNA或RNA)物质进行基因组或转录组的测序[4]，尤其适用于识别新标记、稀有亚群和进化模式[2]。

肿瘤是正常细胞经历一系列的基因突变以及突变在体细胞中的积累发展而成的。这些基因突变会导致细胞恶性分化，如无限增殖、转移和血管生成等。在细胞分化过程中，肿瘤细胞中的遗传特性差异形成了复杂的肿瘤异质性。同时，肿瘤所在的微环境也发生剧烈变化，影响着肿瘤的进展和治疗效果。目前，单细胞测序技术已应用于各种类型的恶性肿瘤中，同时也在妇科恶性肿瘤中得到广泛应用。

2 单细胞测序技术在妇科恶性肿瘤中的应用

2.1 肿瘤的异质性研究 所谓“肿瘤异质性”，涉及到肿瘤患者之间的异质性和肿瘤细胞之间的差异性。在肿瘤细胞内既有致病的亚群，也有非致病的亚群，不同的细胞表现出不同的生物学功能。而肿瘤细胞间的遗传和非遗传性差异即被称为肿瘤内异质性[5]。

Regner等[6]利用scRNA-seq和单细胞水平转座酶可及染色质分析技术(scATAC-seq)分别对手术切除后立即处理的卵巢癌和子宫内膜癌进行单细胞下的匹配转录组和染色质可及性分析，揭示了肿瘤的细胞异质性，并将染色质可及性变化与基因表达定量地联系起来。Li等[7]利用scRNA-seq技术对宫颈癌中单个细胞进行分析，通过比较肿瘤源性内皮细胞和正常内皮细胞的表达差异，揭示了不同代谢基因和免疫调节相关的信号通路在内皮细胞恶变中所起的重要生物学功能。Hashimoto等[8]通过Nx1-seq技术对子宫内膜样腺癌组织进行单细胞转录组分析，通过比较子宫内膜侧(Endometrial side，E侧)和肌层浸润侧(Myometrial infiltration side，M侧)两个部位的癌组织细胞群之间的差异，发现E侧许多细胞对与肿瘤发生相关的特异性标记物呈阳性反应，而作为预后标志物的浸润性T细胞则在E侧较少，由此可见具有高度恶性潜能的细胞存在于肿瘤组织的同一部位。Li等[9]利用scRNA-seq分析卵巢癌细胞间异质性，并确定了1124个差异表达基因，这些差异表达的基因富集于多种与肿瘤相关的途径，如代谢途径、肿瘤途径和PI3K-Akt信号通路。Olbrecht等[10]对高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer，HGSOC)进行单细胞测序，通过评估单个细胞中的分子亚型特征，预测不同分子亚型对预后的影响。非遗传异质性(non-genetic heterogeneity，NGH)由肿瘤细胞状态间的相互分化所致，代表了肿瘤的适应能力，其量化受到遗传异质性的干扰。Hu等[11]对6000个输卵管上皮(fallopian tube epithelium，FTE)细胞的转录组进行调查，使用亚型特征对浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer，SOC)的表达数据进行反卷积，发现肿瘤内存在大量NGH，阐明了癌细胞中遗传自起源细胞的表型异质性。

2.2 肿瘤的微环境研究 肿瘤微环境是指肿瘤或癌症干细胞所生存的细胞环境，由许多具有一系列不同生物学作用的细胞类型组成，除了恶性细胞外，还包含淋巴管、肿瘤脉管系统和免疫系统的细胞，以及脂肪细胞和成纤维细胞[12]。对肿瘤微环境中不同类型的细胞进行分析，可探究微环境中各种组分对肿瘤细胞生物学功能的影响，同时为肿瘤患者的免疫治疗提供个体化指导方案。

Guo等[13]利用scRNA-seq技术对子宫内膜癌(EC)和癌旁组织进行微环境分析，发现EC样本中上调的基因主要与肿瘤生物学行为有关，如促进上皮细胞增殖及增强RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的功能，提示肿瘤的恶性程度；瘤旁对应物中表达水平较高的基因主要与蛋白水解的负调控及其相关的酶有关，而蛋白水解酶在肿瘤微环境中具有活性，被认为与肿瘤进展相关。Cochrane等[14]对子宫内膜癌的单细胞测序发现了纤毛细胞标记物(DYDC2、CTH、FOXJ1、和p73)和分泌细胞标记物MPST在子宫内膜肿瘤中表达，并与子宫内膜癌患者的疾病特异性和总生存期呈正相关。Hornburg等[15]对15个卵巢肿瘤的微环境进行了scRNA-seq分析，描述了不同表型和功能的T细胞和骨髓细胞状态，以及它们在肿瘤免疫表型(tumor immune phenotypes，TIPs)中的差异性富集。Launonen等[16]在BRCA1/2mut(BRCA1/2 mutation)HGSOC中发现了一个具有独特表型和较强免疫监视的肿瘤微环境，且BRCA1/2mut肿瘤中CD8+和CD4+T细胞增强的肿瘤免疫相互作用与增殖性肿瘤细胞亚群的预后有关。

癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)被广义定义为位于肿瘤内或肿瘤附近的成纤维细胞，已从前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等多种恶性组织中分离得到，但在卵巢癌标本中相对少见[17]。Izar等[18]对晚期HGSOC患者恶性腹水的scRNA-seq研究显示，恶性与非恶性细胞的细胞状态和程序存在显著差异。在非恶性细胞中可观察到CAF的多样性，其中炎性CAF大量表达IL-6和其他细胞因子，并可能促进肿瘤生长和耐药性。

2.3 肿瘤的进展与转移 单细胞测序技术能识别并表征一些在肿瘤进展与转移中发挥关键作用的细胞亚群及异常基因，包括他们在原发肿瘤中的定位，以及遗传与非遗传因素、内在与外在因素对肿瘤转移的影响[19]。scRNA-seq可提供单个肿瘤细胞中基因表达和单核苷酸突变的全面信息，用以探究原发性和转移性肿瘤之间的遗传和转录异致性，从而分析某些肿瘤细胞的转移与基因突变的关系，为探究并控制肿瘤的转移提供新途径[20]。

Gu等[21]利用scRNA-seq技术，通过比较宫颈癌和宫颈炎患者成纤维细胞和内皮细胞中基因的差异性表达，发现在数种恶性肿瘤中曾报道的几种癌症标记基因——包括参与翻译起始的基因RPL10和RPS3，与参与铁代谢的调节基因FTLs——在宫颈癌的内皮细胞中显著升高，它们可通过各种代谢途径参与肿瘤血管生成、转移和侵袭。Olalekan等[22]对6例卵巢癌患者大网膜中分离的9885个细胞进行了单细胞RNA测序，并基于免疫特征将样本分为高T细胞浸润(高Tinf)组和低T细胞浸润(低Tinf)组，发现在高Tinf组中巨噬细胞和B细胞簇具有独特的转录亚簇，提示可能产生抗肿瘤免疫反应。Velletri等[23]提出从患者的卵巢癌转移性腹水中分离单个细胞并将其作为3D培养物进行繁殖，通过scRNA-seq技术分析转移性腹水细胞的组成，这种3D培养产物被称为单细胞源性转移性卵巢癌球体(single cell-derived metastatic ovarian cancer spheroids，sMOCS)。研究发现,sMOCS能保留并扩增原始患者样本中的关键亚群，并囊括了经典2D培养中未出现的原始转移特征，为卵巢癌的精确肿瘤学提供了强有力的工具。刘东满等[24]通过石蜡切片提取单细胞悬浊液，分别检测子宫系列病变组织中p15、MDM2表达情况。结果表明p15基因表达与EC的恶性程度呈正相关。因此，p15、MDM2蛋白的表达可作为EC的危险性评估、早期诊断及预后和复发判定的新途径。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是子宫内膜癌[25]、宫颈癌[26]和卵巢癌[27]发生发展和转移侵袭过程中重要的组成部分，也有望成为肿瘤治疗的新靶点。Smit等[28]利用功能性单细胞测序(functional single cell sequencing，FUNseq)技术分析了位于2D上皮细胞团中心不同距离的细胞，发现位于最外缘的细胞富含能刺激EMT的配体和受体，如Ephrin、EGF和VEGF信号通路的组分，进而激活EMT过程。但妇科肿瘤EMT进程中的微环境和细胞异质性尚有待研究。

2.4 肿瘤治疗反应 单细胞测序技术可提供肿瘤从化疗敏感到耐药进展的过程中肿瘤微环境发生的变化。Schefter等[29]通过比较化疗前和化疗后卵巢癌的scRNA-seq数据集发现，与化疗前样本相比，化疗后样本中检测到的癌症上皮细胞类型、免疫和基质成分存在差异。基于这些细胞簇中的基因表达模式，可确定特定的信号通路和细胞类型，这些信号通路和细胞类型表明了在肿瘤微环境中用于产生对化疗耐药性的可能机制。

此外，单细胞技术可检测复杂肿瘤中微小的耐药细胞群，用于选择合适的治疗方案[30]。Zhao等[31]对卵巢癌(OC)、正常卵巢组织和胚胎组织采用10倍单细胞测序，发现PEG10在顺铂耐药和复发组中较高，并证实了PEG10缺乏通过抑制肿瘤干细胞的自我更新信号传导来抑制OC细胞增殖并影响OC细胞对顺铂的敏感性。Yu等[32]发现，EC中恶性细胞可能通过与耗尽的T细胞相互作用，诱导免疫抑制微环境，从而潜在地驱动对PD-L/PD-L1免疫治疗的抵抗，且vCAF(vascular CAF)可抑制免疫细胞浸润，是EC的独立危险因素。

3 总结及展望

单细胞测序技术仍有较多不足之处。scRNA-seq的一个主要问题是由于测序样本中杂质含量过高和转录样本的丢失过多会造成数据量较大、变异度较高和表达较复杂的样本未被检出[33]。此外，由于每个细胞中所含的DNA或mRNA量非常少，因此需先进行全基因组或全转录组扩增步骤，但完全的全基因组扩增难以实现，而未经扩增的区域不能被测序；同时，两个样本中基因表达水平相同，但扩增效率可能不一致，从而导致扩增后表达谱产生偏倚[34]。

单细胞测序技术的不断发展以及其与多领域技术和算法的结合将会为下一代基因组测序带来一场新的革命，其在妇科恶性肿瘤中的广泛运用极大地推动了该领域的研究和发展。通过对单个细胞基因组的测量，可较精准地探究肿瘤细胞的发生发展机制，评估肿瘤微环境中各种细胞的分布和活性，并从中发现新的治疗靶点，同时提供更有效的观察肿瘤进展、治疗反应及预后的指标。