盐酸戊乙奎醚调控miR-183-5p表达对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

靳 涛，武 倩，董 雨，崔晓东

脑缺血或缺血性脑卒中是常见的急性脑血管疾病，严重威胁人类身体健康，缺氧引起的神经细胞损伤是其发病的重要因素，开发新的药物用于神经保护对其治疗具有重要意义[1-2]。盐酸戊乙奎醚又名长托宁，是一种选择性抗胆碱药，作为逆转剂和麻醉药被广泛应用于临床。研究显示，长托宁对心脏、肺、大脑等多器官具有保护作用[3]。研究显示，长托宁对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障通透性具有保护作用[4]。长托宁预处理可通过抑制海马组织细胞外信号调节激酶的(ERK)1/2激活而减轻小鼠反复缺血-再灌注脑损伤并改善其学习记忆能力[5]。长托宁可能通过抑制肺组织氧化应激和细胞凋亡，减轻新生大鼠内毒素性急性肺损伤[6]。然而长托宁对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响及机制尚不明确。研究表明，微小RNA(miRNA)参与缺血性脑卒中的一系列病理生理过程[7]。缺血小鼠神经母细胞瘤细胞N2A细胞中miR-183-5p表达降低，miR-183-5p过表达，通过负调控张力蛋白同源物(PTEN)减轻脑缺血损伤[8]。上调miR-183-5p表达可抑制炎症反应和氧化应激，减轻脑出血后的早期损伤[9]。因此，本研究探讨长托宁对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响及其与miR-183-5p的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞株(货号：XB-3033，上海奥陆生物科技有限公司)；RPMI-1640培养基(货号：YB150110B，上海钰博生物科技有限公司)；长托宁(货号：100931，上海彩佑实业有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(货号：1531704953)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(货号：1533806644)、丙二醛(MDA)试剂盒(货号：1534619774)均购自上海江莱生物科技有限公司；细胞凋亡试剂盒(货号：A025，美国GeneCopoeia公司)；RIPA蛋白裂解液(货号：AR0102)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(货号：AR0146)均购自武汉博士德生物工程有限公司；TaqMan MicroRNA定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(货号：MTTXXXXX-ZCO，北京百奥莱博科技有限公司)。

1.2 细胞处理与分组 PC12细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、95%O2、5%CO2条件下培养作为对照组；将PC12细胞置于37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2条件下培养24 h作为缺氧组；分别用0.01 μmol/L、0.03 μmol/L、0.10 μmol/L的长托宁处理PC12细胞，再进行缺氧处理，作为缺氧+长托宁低、中、高剂量组；将miR-NC、miR-183-5p转染至PC12细胞后进行缺氧处理，作为缺氧+miR-NC组、缺氧+miR-183-5p组；将anti-miR-NC、anti-miR-183-5p转染至PC12细胞后，经0.1 μmol/L的长托宁处理，再进行缺氧处理，作为缺氧+长托宁+anti-miR-NC组、缺氧+长托宁+anti-miR-183-5p组。

1.3 LDH漏出率、SOD活性、MDA含量的检测 收集各组细胞及细胞培养上清液，根据试剂盒说明书方法，检测细胞培养上清液中LDH漏出率以及细胞中SOD活性、MDA含量。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集各组细胞，漂洗后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混匀，避光孵育10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测Bcl-2、Bax蛋白表达 RIPA裂解液提取总蛋白、BCA测定蛋白浓度；蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、封闭，将膜放入杂交袋中，倒入稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，倒掉一抗，洗膜；加入稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温摇床孵育2 h，洗膜后用电化学发生(ECL)法显色，暗室显影、定影。Quantity-One分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参分析蛋白相对表达水平。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-183-5p表达水平 提取细胞总RNA后反转录成cDNA，用TaqMan MicroRNA定量PCR试剂盒检测miR-183-5p相对表达水平，以U6为内参，采用2-△△Ct公式进行计算。miR-183-5p正向引物序列：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，反向引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 结 果

2.1 长托宁对缺氧诱导PC12细胞氧化应激的影响 与对照组比较，缺氧组LDH漏出率增多、SOD活性降低、MDA含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与缺氧组比较，缺氧+长托宁低、中、高剂量组LDH漏出率依次减少、SOD活性升高、MDA含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；缺氧+长托宁低、中、高剂量组LDH漏出率减少、SOD活性依次升高、MDA含量依次降低，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 长托宁对缺氧诱导PC12细胞氧化应激的影响(±s)

2.2 长托宁对缺氧诱导PC12细胞凋亡的影响 与对照组比较，缺氧组PC12细胞凋亡率升高、Bcl-2蛋白表达水平降低、Bax蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与缺氧组比较，缺氧+长托宁低、缺氧+长托宁低中、缺氧+长托宁低高剂量组PC12细胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表达水平升高、Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；缺氧+长托宁低、中、高剂量组PC12细胞凋亡率依次升高、Bcl-2蛋白表达水平依次降低、Bax蛋白表达水平依次升高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表2。

图1 长托宁对缺氧诱导PC12细胞凋亡的影响

表2 长托宁对缺氧诱导PC12细胞凋亡的影响(±s)

2.3 长托宁对缺氧诱导PC12细胞中miR-183-5p表达的影响 与对照组比较，缺氧组miR-183-5p表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与缺氧组比较，缺氧+长托宁低、缺氧+长托宁中、缺氧+长托宁高剂量组miR-183-5p表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧+长托宁低、中、高剂量组miR-183-5p表达水平依次升高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 长托宁对缺氧诱导PC12细胞中miR-183-5p表达的影响(±s)

2.4 miR-183-5p过表达对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的影响 与缺氧+miR-NC组比较，缺氧+miR-183-5p组miR-183-5p表达水平升高，LDH漏出率减少，SOD活性升高，MDA含量降低，PC12细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2及表4。

图2 miR-183-5p过表达对缺氧诱导PC12细胞凋亡的影响

表4 miR-183-5p过表达对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的影响(±s)

2.5 抑制miR-183-5p表达对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的影响 与缺氧+长托宁+anti-miR-NC组比较，缺氧+长托宁+anti-miR-183-5p组miR-183-5p表达水平降低，LDH漏出率增加，SOD活性降低，MDA含量升高，PC12细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3及表5。

图3 抑制miR-183-5p表达对缺氧诱导PC12细胞凋亡的影响

表5 抑制miR-183-5p表达对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的影响(±s)

3 讨 论

脑缺血后可发生氧化应激、神经细胞凋亡、炎症反应等一系列病理过程，进而引起神经细胞损伤[10-11]。PC12细胞是研究脑缺血损伤常用的细胞模型，本研究用缺氧诱导PC12细胞模拟脑缺血细胞损伤。研究报道，长托宁对小鼠脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，其可抑制炎性因子的释放和氧化应激的产生[12]。长托宁通过减轻细胞凋亡和内质网应激减轻脂多糖诱导的急性肺损伤[13]。长托宁抑制细胞凋亡和氧化应激，对缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤具有保护作用[14]。本研究结果显示，不同剂量长托宁处理后，缺氧诱导PC12细胞中LDH漏出率减少、SOD活性升高、MDA含量降低、PC12细胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表达水平升高、Bax蛋白表达水平降低，表明长托宁可抑制缺氧诱导PC12细胞的氧化应激和细胞凋亡。

研究显示，过表达miR-183-5p可抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡[15]。miR-183-5p的过表达增加了应激条件下神经元的存活率，在肌萎缩性侧索硬化症中保护神经元免受细胞死亡[16]。本研究结果显示，缺氧诱导PC12细胞中miR-183-5p表达水平降低，miR-183-5p过表达降低了缺氧诱导PC12细胞中LDH漏出率、MDA含量，提高了SOD活性，降低了细胞凋亡率，表明miR-183-5p过表达具有抗缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的作用。且本研究还发现，长托宁处理可提高缺氧诱导PC12细胞中miR-183-5p表达水平，而抑制miR-183-5p表达逆转了长托宁对缺氧诱导PC12细胞氧化应激和凋亡的作用。

综上所述，长托宁可能通过上调miR-183-5p表达抑制缺氧诱导PC12细胞氧化应激和细胞凋亡。