丹蒌片改善大鼠急性心肌缺血的作用研究

谭亚芳，潘诗婷，祁建勇，张敏州

心肌缺血是常见的心血管疾病，预防和治疗心肌缺血已成为研究热点。中医理论认为气虚血瘀是心肌缺血的病机。丹萎片秉承痰瘀同治法，具有通阳散结、行气祛痰的功效，可用于改善冠心病心绞痛痰瘀互结型病人的临床症状[1-3]、减少心肌细胞凋亡[4]、改善心室重构[5]、调节心律失常[6]、改善血脂紊乱等[7]，对心肌缺血具有保护作用[8]。本研究建立大鼠急性心肌缺血模型[9]，探讨丹蒌片对心肌缺血的保护作用机制，阐明丹蒌片改善心肌缺血的优势和作用靶点，为防治心肌梗死和再灌注损伤提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性健康SD大鼠190只，8～10周龄，体质量(230±20)g，购于广东省医学实验动物中心，饲养于广东省中医院无特定病原体(SPF)级动物实验中心，许可证号：SYXK(粤)2018-0094。所有动物实验及饲养方案均遵照中华人民共和国动物处理条例(条例号：552001)，且所有动物实验均在广东省中医院动物伦理委员会允许下进行。

1.2 药物、试剂和仪器 丹蒌片超微粉(吉林康乃尔公司生产)；异丙肾上腺素(SIGMA公司生产)，美托洛尔(SIGMA公司生产)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂PD98059(CST公司生产)，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002(CST公司生产)，钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(CST公司生产)，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂L-NAME(CST公司生产)；7180全自动生化分析仪，Cobas e601电化学发光分析仪。

1.3 动物模型的建立和给药 参考文献方法及本实验室既往研究基础制定手术方案，连续两天皮下注射异丙肾上腺素85 mg/kg构建大鼠急性心肌缺血模型[10]。

1.3.1 现象实验 选取SD大鼠40只，随机分为对照组、异丙肾上腺素组、丹蒌片1 000 mg/kg组、美托洛尔组，每组10只，给药2 d，具体给药方法见表1。

表1 现象实验各组给药方法

1.3.2 量效实验 选取SD大鼠80只，随机分为生理盐水组、异丙肾上腺素组、美托洛尔组、丹蒌片5 mg/kg组、丹蒌片50 mg/kg组、丹蒌片100 mg/kg组、丹蒌片500 mg/kg组、丹蒌片5 000 mg/kg组，每组10只，给药2 d，具体给药方法见表2。

表2 量效实验各组给药方法

1.3.3 机制实验 选取SD大鼠60只，随机分为异丙肾上腺素组、丹蒌片组、PD98059组、LY294002组、KN93组、L-NAME组，每组10只，给药2 d，具体给药方法见表3。

表3 机制实验各组给药方法

1.4 检测指标 大鼠血液的心肌酶5项及肌钙蛋白：由广东省中医院大学城医院检验科收取样本，7180全自动生化分析仪检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、α-羟丁酸脱氢酶(α-BDH)；采用电化学发光法检测肌钙蛋白T(cTnT)。

2 结 果

2.1 现象实验 与对照组比较，给药后异丙肾上腺素组AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与异丙肾上腺素组比较，丹蒌片1 000 mg/kg组和美托洛尔组给药后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 现象实验血液检测指标(±s)

2.2 量效实验 与对照组比较，异丙肾上腺素组给药后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与异丙肾上腺素组比较,美托洛尔组、丹蒌片5 mg/kg组、丹蒌片50 mg/kg组、丹蒌片100 mg/kg组、丹蒌片500 mg/kg组、丹蒌片5 000 mg/kg组给药后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中，不同丹蒌片给药剂量组AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平下降幅度不同，且丹蒌片100 mg/kg组各指标下降幅度最大。详见表5。

表5 量效实验血液检测指标(±s)

2.3 机制实验 与对照组比较，异丙肾上腺素组给药后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与异丙肾上腺素组比较，丹蒌片组、PD98059组、LY294002组、L-NAME组、KN93组给药后心肌酶AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表6。

表6 机制实验血液检测指标(±s)

3 讨 论

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。血压降低、主动脉供血减少、冠状动脉阻塞可直接导致心脏供血减少、心瓣膜病、血黏度变化，心肌本身病变也会使心脏供血减少。

研究显示，丹蒌片可缓解不稳定型心绞痛、高脂血症，改善代谢综合征病人的血管内皮功能。缪静等[11]观察了丹蒌片对动脉粥样硬化(AS)大鼠血清抵抗素(resistin)、内皮素-1(ET-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)水平的影响，探讨丹蒌片对AS模型大鼠血管内皮的保护作用及可能机制，结果表明，丹蒌片可通过降低AS模型大鼠血清抵抗素、ET-1、IL-6 和TNF-α水平，升高NO 水平，减轻AS模型大鼠血管内皮损伤，作用与他汀类药物相似，表明丹蒌片亦可保护血管内皮，其作用机制可能是通过降低血清抵抗素、ET-1、IL-6和 TNF-α水平，增加 NO 的分泌，从而保护血管内皮细胞结构的完整和功能的完善，揭示了丹蒌片对急性心肌缺血的可能机制。李琳等[4]研究显示，丹蒌片通过上调Bcl-2的表达、下调Caspase-3的表达，从而减轻心肌细胞凋亡、减少心肌梗死面积，保护心肌缺血损伤。虽然丹蒌片改善心肌缺血的疗效已在临床得到证实，但其潜在的机制尚未明确。

本研究通过假设丹蒌片可改善大鼠急性心肌缺血，并通过检测大鼠血液的心酶5项和cTnT值，评估丹蒌片对大鼠急性心肌缺血的改善作用。同时通过给予通路抑制剂来排除得到丹蒌片治疗急性心肌缺血的潜在机制，证实了异丙肾上腺素连续皮下注射2 d大鼠急性心肌缺血模型造模成功，结果还显示美托洛尔和丹蒌片都具有抗心肌缺血的作用，且丹蒌片与美托洛尔效果相当，但仍需进一步明确其作用机制。