基于网络药理学分析贾跃进老师膏方调治慢性失眠经验

王瑞敏，刘 毅，刘 宁，李 菲，贾跃进

失眠(insomnia)指以入睡困难、睡眠维持困难或早醒，并伴有如疲劳、注意力不足和情绪不稳定等日间功能障碍为主要症状的疾病[1]，其患病率为10%～20%，而其中约50%为慢性失眠[2]。慢性失眠指病程>3个月的失眠[1]，通常被认为是高血压、糖尿病、抑郁症、焦虑症等躯体或精神疾病的危险因素，对人体有较大危害[3-4]。现代医学治疗失眠的药物缺乏长期疗效的证据，且长期应用存在不良反应，应对慢性失眠尚无理想药物[5-6]。膏方具有缓补慢调、治病求本的特点，擅于调治慢性疾病，且安全、有效，同时兼具较佳的口味，因此，适合慢性失眠病人的长期治疗，而且通过研究名老中医膏方调治慢性失眠的经验有利于传承中医思维、推广适宜技术、指导临床应用、研究开发药物。

贾跃进老师是第六批全国名老中医药专家工作室指导老师，临证40余年，尤其擅长治疗失眠症、抑郁症等精神科疾病以及应用膏方调治慢性病和亚健康状态。鉴于膏方受中医理论指导，其反映的信息具有大数据的特点，而其组方机制具有多成分、多靶点、多通路的复杂网络特性，因此，本研究结合理论分析、数据挖掘及网络药理学方法分析贾跃进老师膏方调治慢性失眠的经验，以反映其中体现的中医思维、用药规律与可能机制。

贾跃进老师膏方调治慢性失眠的思路为：①开路为先，首重三辨。正式服用膏方之前，应先服一段汤剂，名之“开路方”，其作用有三：一为利用汤剂，“汤者，荡也”之性，较快祛除病邪，稳定、缓和病情，使病人体质易于接受膏方调治；二为调理脾胃功能，为病人更好地吸收膏方治疗成分创造条件，贾跃进老师常于脾虚湿盛病人服膏方前开一些健脾化湿药材之故，逮为此也；三为因一料膏滋常需服用1～2个月，若病人药后不适，或药不对症则难以更改，恐造成损失，此时则可以“开路方”摸索对证、观察疗效，以保周全。贾跃进老师认为“开路方”尤应注重三辨，即辨病、辨证、辨体，以求能正确引导膏方的制定。使用膏方调治慢性失眠亦同理，首当根据诊断标准诊断为慢性失眠，次当辨明是何证，而对于体质，久病失眠，势必虚实夹杂，临床慢性失眠病人常存在肝郁、脾虚、虚火、痰湿等体质偏向，故贾跃进老师多分别投以香砂六君子汤、丹栀逍遥散、柴芩温胆汤等方加减以扶正祛邪、调理脾胃、纠正体质。②顾护脾胃强调疏肝。中医学在《黄帝内经》时期就构建了失眠的疾病模型，如：“卫气不得入于阴，长留于阳，则阳气满，阳气盛则阳蹻盛，不得入于阴则阴气虚，故不目瞑[7]。”从营卫、阴阳节律周期的角度进行了阐释；而“人以气为主，一息不运则机缄穷，一毫不续则穹壤判”[8]，可见气的运行直接调控着人体的生命活动，营卫、阴阳亦如是，因此贾跃进老师认为“百病生于气”，并在此基础上将失眠的总病机“营卫失和、阴阳不交”[9]，归结于气机失常，而进一步具体到脏腑，则责之与气机相关性较大的肝、脾(胃)两枢机。从长期失眠的临床发病原因来看，现代人多处于一定压力之下，情志不舒者众，加之嗜食辛辣肥甘，易伤脾胃，同时情志失常可致肝郁而进一步侵犯脾胃，造成肝脾(胃)不调，“胃不和则卧不安”，从而失眠，而长期失眠病人的病机存在一定的变化和转归，主要是郁而化热和易生痰湿等肝脾相关病理变化。膏滋中用药较为滋腻，补益药较多，因此在运用膏方时本就应佐以理气健脾之品，而调治慢性失眠则更应强调，故贾跃进老师常用二陈、四君之类方加减，另辅柴胡、香附、砂仁、枳实、党参、黄芪、麦芽、莱菔子等加强健脾行气，合欢皮、酸枣仁、首乌藤、远志等加强养心安神，并根据体质偏向补充对应补益药，如是“方对证，药对症”，则可“阴平阳秘、精神乃治”。③时令相宜，搭配关键。中医讲究“人与天地相参”，认为环境、时令、气候等对人体的生理状态是有影响的，人应当顺应自然，方能达到调治养生的目的。膏方在一年四季均可服用，而贾跃进老师则提倡冬季使用。因冬季特点是气候寒冷，阳气闭藏，此时人体处于抑制、收缩、降低的生理状态，正气最易不足，寒邪却盛极，最易生病；加之中医认为“冬藏精”，该令进补能使人体吸收营养物质转化的能量，最大限度藏于体内；且冬至起九，是一年中阴气极盛而阳气始生的转折点，即《易经》所言“冬至一阳生”，在此时进补有扶正固本、萌育元气、养精蓄锐之功。对于慢性失眠病人亦是同理，“久病多虚”，冬季服用膏方可最大限度吸收药物的治疗成分，补益其虚损，顾护其脾胃，条畅其气机，而使“正气存内、邪不可干”。此外，膏方组分为饮片类、细料类、胶类和糖类等，其中饮片类、细料类是发挥扶正补益、祛邪疗疾、健脾开胃的主要成分，亦即通过“三辨”而确定的药物组成；糖类往往是赋形、矫味的作用；而胶类则兼具前两者的功能。而由于糖类、胶类成分比较固定，因此在数据挖掘验案的过程中只分析饮片及细料类药物。

1 资料与方法

1.1 数据挖掘分析

1.1.1 数据收集 收集2015年11月10日—2020年11月10日贾跃进老师在山西中医药大学附属医院治未病中心门诊诊断为慢性失眠的膏方验案。

1.1.2 纳入与排除标准

1.1.2.1 纳入标准 根据《精神障碍诊断与统计手册》(DSM-5)[10]明确诊断为慢性失眠并单纯口服中药膏方治疗的安全、有效验案(通过症状、随访、治疗前后体检指标和量表分析进行判断)。

1.1.2.2 排除标准 诊断、效果或安全性不明确以及资料缺失的病案；合并其他影响判断的躯体及精神病者；干预方式非单纯使用中药膏方、使用中药其他剂型或使用膏方方式非口服者。

1.1.3 数据标准化、录入与挖掘 通过纳入与排除标准进行筛选，以双人双录入法录入古今医案云平台V2.2.3提供的模板中，确保准确后使用其数据标准化模块并结合2015版《中华人民共和国药典》[11]与第7版《中药学》[12]对中药进行名称规范，如：“潞党参”规范为“党参”，“仙灵脾”规范为“淫羊藿”，“醋香附”规范为“香附”，“酒萸肉”规范为“山萸肉”，“怀山药”规范为“山药”等。获得标准化数据后，使用数据挖掘模块分别对其进行药物频次、性味归经统计(其主要依据参考文献[11-12])以及关联分析、聚类分析和复杂网络分析，并综合获得核心组方。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 药物有效成分及对应靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)分别检索核心组方中各药物成分，并限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，血脑屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，并匹配各成分靶点，对于无靶点记录的有效成分则利用SwissTargetPrediction平台(http：//www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点，最终将靶点在UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2.2 疾病靶点获取 在Gene Expression Omnibus数据库(GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、基因名片数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https：//omim.org/#)、Therapeutic Target Database(TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)中分别检索“insomnia”，得出失眠相关靶点，并将3个数据库所得失眠相关靶点合并、去重，再利用Uniprot数据库筛选。

1.2.3 药物-疾病交集靶点获取 将获得的有效成分相关靶点与疾病相关靶点取交集，获得核心药物组合有效成分中直接与疾病相关的靶点。

1.2.4 疾病-药物-成分-靶点及蛋白相互作用(PPI)网络构建 以疾病、核心组方、药物、有效成分和相关靶点为节点，其相互关系为边，在CytoscapeV 3.8.0中构建网络，并利用插件对药物-疾病交集靶点进行PPI网络构建、拓扑分析和聚类分析。

1.2.5 基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 将所得到的药物-疾病交集靶点导入Cytoscape的BiNGO、ClueGO插件，分别进行GO和KEGG通路富集分析，然后将其可视化。

1.2.6 关键有效成分与关键靶点分子对接分析 选取1.2.4两个网络中节点度较大的关键成分及关键靶点分别在Zinc(https：//zinc.docking.org/)、RCSB蛋白质结构(PDB)数据库中(http：//www.rcsb.org/)获取3D结构，并使用Vina分子对接，将其中对接最好的组合使用Pymol可视化。

2 结 果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 药物频次及属性统计 共收集到病案213例，按纳入、排除标准筛选，获得验案122例。该122例验案包含方剂138首，涉及中药154味，其中药物应用频率>40%的有18味(见表1)。将154味中药进行性味归经分析，结果以雷达图表示(见图1)，其中，中药药性分布主要为平、温；药味主要为甘、辛、苦；药物的归经主要归脾、肝、肾、肺经。

表1 138首膏方药物使用频次频率(频率>40%，n=138)

图1 138首膏方四气、五味、归经频次分布雷达图

2.1.2 药物关联分析、聚类分析、复杂网络分析及核心组方确定 将138首处方利用云平台数据分析，设置置信度≥0.80，支持度≥0.60，得到19组药物关联分析结果(见表2)；将药物使用频率>40%的18味中药进行聚类分析，同时设置距离类型为欧氏距离，聚类方法为最长距离法，将其分为3个聚类处方(见图2)，C1：黄芪、当归、白芍、合欢皮、远志、香附、柴胡；C2：延胡索、怀牛膝；C3：党参、半夏、莪术、薏苡仁、麦芽、山药、陈皮、白术、茯苓；设置节点度≥150，进行中药-中药复杂网络分析，得到由白术、茯苓、陈皮、山药、麦芽、黄芪、莪术、香附、党参9味中药组成的核心组合(见图3)。

表2 138首膏方药物关联分析

图2 138首膏方药物聚类分析

图3 138首膏方核心药物复杂网络分析

2.2 网络药理学结果

2.2.1 有效成分和对应靶点 通过检索TCMSP数据库，结合SwissTargetPrediction预测靶点，筛选出核心组方各药物有效成分及相关靶点。经去重、排除后，共获得有效成分72种，重复成分5种，相关靶点476个。详见表3。

表3 膏方核心处方部分成分相关信息

(续表)

2.2.2 疾病靶点 将GEO数据库得到的数据集(编号：GSE122541)中的22个睡眠正常的基因表达样本与22个睡眠剥夺的基因表达样本用R语言进行差异分析，共得到100个差异基因靶点，见图4。将GeneCards数据库中得到的2 563个失眠相关基因按照相关度大于中位数进行筛选，获得1 074个疾病靶点；此外，OMIM和TTD分别获得295个、28个靶点。最终，共计获得失眠靶点1 205个。

图4 GEO数据集失眠障碍差异基因分析结果

2.2.3 药物-疾病靶点交集结果 利用微生信平台将获得的药物靶点与获得的疾病靶点取交集，共获得116个药物与疾病直接相关的交集靶点。详见图5。

图5 膏方核心处方药物-疾病交集靶点

2.2.4 疾病-药物-成分-靶点网络和PPI网络构建结果 将数据导入Cytoscape软件，构建疾病-核心组方-成分-交集靶点网络(见图6)。从该网络筛选出Degree>50的12个关键有效成分。在Bisogenet中导入116个交集靶点构建PPI网络，然后通过CytoNCA插件得出PPI核心网络(见图7)，在此基础上使用MCODE插件对核心网络进行聚类，得出10个聚类网络，选择其中每个聚类网络中节点度较大的10个靶点作为关键靶点(见表4)。

图6 疾病-核心组方-成分-交集靶点网络

图7 交集靶点蛋白互作(PPI)网络筛选图

表4 关键成分与关键靶点分子对接结果

2.2.5 GO富集分析和KEGG富集分析结果 将药物-疾病的交集靶点导入BiNGO，并设置信水平为0.01，进行GO富集分析(见图8)，得到GO生物过程主要包括生物调节、对刺激的应答、细胞过程、代谢过程、信号过程、节律过程、免疫系统过程等；GO分子功能包括结合、分子转导活性、催化活性等；GO细胞成分以突触、胞外区、细胞器等为主。再将交集靶点导入ClueGO，设定P≤0.05，最小聚类为4，К-score为0.4进行KEGG通路富集分析(见图9)，得到神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触、雌激素信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路等。

图8 交集靶点GO富集分析主要结果关联图

图9 交集靶点KEGG关键通路图

2.2.6 分子对接结果 关键靶点和关键成分分子对接结果大多≤-20.9 kJ/mol，提示关键成分与关键靶点多可能形成稳定结构(见表4)。其中对接最好的组合为AKT1与BZ1，其主要由疏水口袋与氢键结合(见图10)。

图10 AKT1与α-Amyrin分子对接构象

3 讨 论

从数据挖掘结果可得，调治慢性失眠的膏方中使用频率最高的药物为白术、茯苓、陈皮、山药、麦芽、黄芪、莪术、香附、党参等。现代药理学研究认为上述药物具有神经保护、镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑等作用，且大多数具有保肝及调理胃肠道的功效[13-23]。根据药性、药味、归经分布规律分析，贾跃进老师所开膏方用药较平和，结合频率来看则可见其用药略偏温，因慢性失眠病人多存在肝脾不和的情况，脾土亏虚，贾跃进老师善用甘温，其中甘味药补益气血、顾护脾胃、调和诸药，而肝郁表现为全身气机的失常，“气有余便是火，气不足便是寒”而寒热均见，故投以辛、苦味药，辛开苦降，通利枢机，通腑降气，则气机自和；药物归经则集中在脾、肝、肺、肾、心、胃，因脾升胃降、肝升肺降、水火既济，皆为全身气机运转之枢机，尤其是前两者，更是服用膏方与调治慢性失眠所共同强调的脏腑，此处足见贾跃进老师以调气为先、重视肝脾、整体论治的思路。药物关联分析中筛选出的19对核心关联组合是：白术、茯苓、陈皮、山药、麦芽、黄芪、莪术、香附、党参9味药物的组合，其中香附为“气中之血药”，在行气解郁的同时兼顾血分；莪术可破血行气，为化瘀之要药，有助香附行气之功；陈皮、茯苓为二陈汤、温胆汤、保和丸的成分，可健脾行气、利湿安神；茯苓、白术是常用治疗脾胃气虚的药对，四君子汤、逍遥散、参苓白术散、香砂六君子汤等类方均含此药对；党参补益气血、健脾益肺，贾跃进老师常以之代人参，黄芪则可遍补三焦，益卫利水，二者可组成归脾汤、补中益气汤、十全大补汤等补益剂；山药可通补脾胃肺肾，是薯蓣丸、六味地黄丸等的重要成分；麦芽则被认为是“禀受春生之气，脾胃药而善舒肝”，故贾跃进老师常佐以顾护脾胃并疏肝气。综合来看，贾跃进老师膏方调治慢性失眠，师丹溪越鞠之法，以“健脾疏肝”为主线，兼顾气、血、痰、郁，意在治病求本。在聚类分析所得的3个聚类处方中，C1主要包括逍遥散、柴胡疏肝散、当归补血汤等方的主要药物及贾跃进老师常用治疗失眠药对合欢皮、远志，体现其临床以疏肝健脾为主旨，调治久病失眠气血不足之法；C3方含半夏秫米汤(贾跃进老师常法鞠通而易秫米为薏苡仁)、二陈汤、四君子汤、参苓白术散、理冲汤等方中的主要药物及贾跃进老师常用的疏肝健脾的佐使药麦芽，反映其临证循健脾理气之主线，并治久病失眠而有瘀或及肾之证；C2聚类中的延胡索及怀牛膝是贾跃进老师临床常用佐药，两者可增益行气活血之功，气血冲和则万病不生。复杂网络分析中所获得的核心组方亦是关联分析中的9味药物。从数据挖掘可得出贾跃进老师膏方调治慢性失眠的核心组方确为白术、茯苓、陈皮、山药、麦芽、黄芪、莪术、香附、党参9味，此9味涵盖了贾跃进老师膏方调治慢性失眠的主要方面，即强调肝脾、兼顾气血、重在缓补。

根据药物网络构建，得出核心组方发挥作用的12个关键有效成分，其中SY1、SY6是两种木脂素类成分，HQ8、HQ9皆为异黄酮类成分，横断面研究显示，此两类成分的摄入量与睡眠质量之间存在显著的正相关[24-25]；FL4、FL5为茯苓中的三萜类化合物，研究显示茯苓中的此类物质可发挥镇静作用[26]；D和E是存在于多种中药材中的植物甾醇，前者在动物实验中被验证可上调谷胱甘肽、γ-氨基丁酸(GABA)水平，下调多巴胺(DA)、丙二醛、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、乙酰胆碱酯酶(AChE)水平从而调节精神症状、改善脑功能[27]，后者则可通过抑制TNF-α的炎症反应来发挥神经保护作用[28]，实验亦证实其可增加小鼠中枢神经系统(CNS)中的去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)等神经递质从而表现抗抑郁活性[29]；EZ2是一种姜黄素衍生物，研究认为其可通过降低氧化应激而表现脑保护作用[30]；DS8被认为存在AChE抑制作用[31]，而AChE抑制剂可改善睡眠状况[32]；XF1属香附中的挥发油类，动物实验得出该类物质可能通过调节胆碱能系统及5-HT水平而表现抗焦虑的作用[21]；BZ1为主要成分的混合物被研究证实具有治疗抑郁的潜力[33]；B成分为主要活性成分的提取物则被实验证实可通过抑制细胞外单胺(包括5-HT、NE和DA)的再摄取来增强中央单胺的信号传导，从而表现抗抑郁作用[34]。

PPI网络所得的核心靶点中，ESR1、AR分别编码雌激素、雄激素受体，而性激素可对睡眠过程产生重要影响，雌激素和孕酮调控女性一生荷尔蒙周期相关的睡眠方式变化，雄激素则可影响昼夜节律的时相[35-36]；CREB1编码磷酸化依赖性转录因子，可参与包括昼夜节律同步等多种细胞过程，并且与快速眼动(REM)睡眠在抑郁症中的作用有关[37]；ADRB2编码β肾上腺素能受体，该基因在清醒及睡眠剥夺时表达上调，其受体阻滞剂常会产生嗜睡等副作用[38-39]；AKT1编码的AKT1激酶在神经元细胞间通讯、神经元存活和记忆形成中发挥作用[40]；MTNR1A编码一种高亲和力的褪黑激素(MT)受体，而MT是一种具有抗氧化、昼夜节律维持、睡眠调节和神经元存活等作用的激素，其外源性补充剂则被证明可用作失眠的替代治疗[41]；NR3C1编码糖皮质激素受体，相关报道根据观察到的服用地塞米松病人存在睡眠障碍的副作用而认为糖皮质激素有促进清醒的作用[42]；GSK3B编码一种糖原合酶激酶，其可作为葡萄糖稳态的负调节剂，参与能量代谢、炎症等生理活动，而目前认为睡眠障碍与这些生理活动都有关[43-44]；此外，炎性因子TNF被动物实验证明其增强或抑制分别促进和抑制睡眠，且在一些人类研究中亦有相同结论[45]；NTRK1编码神经营养性酪氨酸激酶受体，可与神经营养因子结合，相关性研究表明其与抑郁、焦虑、睡眠障碍等症状存在相关性[46]。

目前，失眠的病理机制并不明确，但较公认的为：神经递质调节障碍(GABA、5-HT、DA、NE等)、信号传导障碍(下丘脑-垂体-肾上腺轴，HPA轴)、代谢障碍(能量、脂质、氨基酸及肠道微环境等)、内分泌失调(生长激素、食欲素、性激素等)、免疫功能异常(炎症)、遗传(基因)及心理因素刺激等引起睡眠-唤醒节律紊乱[47-49]，由GO富集分析得到的主要生物过程对上述机制几乎均有涉及，可见膏方核心组方参与多种机制、从多个途径对慢性失眠进行调治。KEGG通路分析主要结果中：神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触、雌激素信号通路、TNF信号通路已在病理机制中概括；除此之外，cAMP的代谢产物腺苷通常被认为是睡眠的平衡调节剂[50]。分子对接结果显示，关键有效成分和关键靶点大多可结合成稳定结构，其中与各关键成分对接较好的靶点为AKT1、GSK3B和NTRK1，而BZ1(α-香树素)、DS8(蒲公英赛醇)和D(豆甾醇)则是与关键靶点对接较好的成分，提示核心组方中的这些成分及靶点相对更可能是贾跃进老师膏方调治慢性失眠的物质基础，即通过AKT1激酶、神经营养因子、糖代谢调节等方面发挥作用。

综上所述，通过对贾跃进老师膏方调治慢性失眠经验的总结以及结合数据挖掘方法分析贾跃进老师的膏方验案，可以得出其结合膏方特点从“肝脾”论治慢性失眠的调治思路以及包括白术、茯苓、陈皮、山药、麦芽、黄芪、莪术、香附、党参9味药物在内的核心组方；进一步利用网络药理学方法初步预测其多成分、多靶点、多通路作用机制，得出所涉及的关键成分为α-香树素、豆甾醇和蒲公英赛醇，关键靶点为AKT1、GSK3B和NTRK1，关键通路为神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触等，该结论可为临床应用和进一步研究提供参考。