新疆克州地区牦牛源大肠杆菌耐药基因检测

阿衣其来克·托合托逊，布左热·吾守

（克孜勒苏职业技术学院，新疆 阿图什市 845350）

牦牛养殖中非常容易感染大肠杆菌，有研究发现，大肠杆菌与牦牛败血症、肠毒血症等疾病存在着密切联系，极易增加牦牛的病死率，带来严重的经济损失[1～2]。目前主要使用疫苗和抗生素进行预防和治疗，但由于大肠杆菌具有多种血清型的特点，仅靠疫苗不能达到良好的防治效果。同时，由于不合理使用抗生素，导致大肠杆菌耐药菌株不断增多，治疗效果也不理想。因此，需深入分析西藏地区牦牛大肠杆菌的耐药情况，对菌株的耐药基因进行检测，以确保临床用药的安全性[1～2]。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020 年5 月至2021 年5 月，在克州乌恰县、克州阿克陶县、克州阿图什市哈拉峻乡，选取牦牛粪便样品120份，放在4℃环境内储存。

1.2 菌株的分离与纯化

无菌环境下，选取样品5 g，放置在37℃摇床内的NB 液体培养基中培养24 h。然后划线接种在恒温培养箱内的麦康凯培养基上，37℃培养18～24 h。选取菌落划线在伊红美蓝培养基平板上，菌落为粉红色、圆形，再次放在恒温培养箱37℃培养24 h。最后选择1 个大肠杆菌疑似菌落放在MH 琼脂培养基平板上，纯化3 代后直接接种在NB 液体培养基中。为了确保后续使用，需用30%甘油将液体封存，放置在-70℃冰箱内保存。

1.3 菌株鉴定

选用细菌脱氧核醣核酸（DNA）提取试剂盒提取菌液DNA，菌株来源于成都Foregene 生物公司。反应条件为95℃，预变性一般设置5 min。其中共有40 个循环，每个循环中的温度在94℃时都会出现变形，变形时间可以达到1 min。54℃退火45 s，72℃需进行延伸，延伸时间1 min。最后72℃时延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统对其进行观察，保存观察内容便于后续使用。PCR 产物需送到武汉擎科生物工程技术有限公司进行测定，在美国国家生物技术信息中心（GenBank）中输入测序序列，随后对比基本局部比对搜索工具（BLAST）使用情况。

1.4 药敏试验

试验方式为纸片琼脂扩散法（K-B 法)。试验需在非常干净的工作台上进行，操作中用蒸馏水稀释细菌液体；麦氏比浊后用无菌棉棒蘸取菌液，均匀涂抹在整个MH 琼脂平板上。涂抹后需立即盖上培养皿，使其处于干燥状态，时间一般控制在5 min。用无菌镊子将药敏片均匀放置在存有菌琼脂板的表面上，药敏片种类包括头孢曲松钠、庆大霉素、氯霉素、链霉素、氧氟沙星等。恒温培养箱中37℃培养24 h，测量抑菌圈直径。选用ATCC25922 的大肠杆菌为质控菌株。

1.5 ESBLs 基因型和基因亚型检测

ESBLs 基因型以及基因亚型检测采用PCR 完成，引物序列和反应方法详见表1。

表1 大肠杆菌耐药基因和毒力基因引物序列

1.6 耐药基因和毒力基因检测

采用PCR 对菌株的耐药基因和毒力基因进行检测，引物同样由武汉擎科生物技术有限公司生产。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离鉴定

在120 份样品中采用鉴别培养、PCR 检测、碱基序列比对等方式进行试验，共分离出103 株大肠杆菌，分离率可达到86.41%。

2.2 药敏试验

在已经分离出的103 株大肠杆菌中，诺氟沙星、头孢噻呋、庆大霉素、安普霉素耐药率分别达到99.6%、100.00%、54.60%和55.8%，磺胺类药物、新诺明耐药率也在96%以上。所有药敏片测试中，庆大霉素、安普霉的耐药率分别为54.60%和55.8%，是所有耐药中最低的。

2.3 耐药基因和毒力基因检测

在已经分离出的103 株大肠杆菌中，11 株至少携带1 种表型耐药基因。与药敏试验的最终结果进行对比发现，药敏试验中可以发现共有31 株耐药菌株。其中，19 株经专业人员检测后发现，没有出现耐药基因。但是有2 个以上耐药基因菌株，在药敏试验中发现存在多重耐药的基本特征。

毒力基因检出率32.6%，40 株菌株中至少有1 种携带了1 种以上毒力基因。其中，10 株菌株携带2 种或2 种以上毒力基因；3株菌株中发现同时携带外膜蛋白A（ompA）和内皮素受体A（etrA）。

3 结论

对120 份样品进行鉴别培养、PCR 检测、碱基序列对比等试验发现，共分离出大肠杆菌89 株，分离率高达86.41%，可以直观说明地区存在大肠杆菌严重污染。不合理使用抗生素治疗和预防大肠杆菌感染，会造成耐药菌株、耐药谱出现逐渐扩大趋势[3]。本次试验数据表明，毒力基因ompA 检出率最高，达到25.00%；其次是etrA，检出率达到22.50%；ESBLs 检出率最低。另外，分离出的103 株大肠杆菌中对头孢他啶和氧氟沙星较敏感。本次试验获取的牦牛源大肠杆菌流行病学特点，可为临床用药的合理性提供可靠数据参考。