印度梨形孢对高丹草生长及Cd吸收与积累的影响

先露露，董智，李红丽，窦晓慧，刘超，刘冰倩，贾丰源

（山东农业大学林学院/泰山森林生态系统定位研究站，山东 泰安 271018）

据2014 年生态环境部发表的土壤污染状况调查公报，全国土壤环境状况不容乐观，耕地、林地、草地和未利用土地土壤点位超标率分别达到19.4%、10.0%、10.4%和11.4%，其中无机污染物中镉（Cd）超标率最高，达到7.0%。重金属Cd 具有隐蔽性强、生物毒性高、毒性持久、不可逆活性强等特点。Cd 不仅会对植物造成毒害作用，且极易通过食物链和富集作用进入人体，危害人体健康。

相关研究表明，低浓度Cd 对植物的生长有一定的促进作用，但高浓度Cd 会对植物产生毒害，使得植物表现出生长缓慢、植株矮小、叶片发黄卷曲、植物根系生长受阻等现象，且在生理方面表现出光合作用受阻、抗氧化系统被破坏、保护酶活性受抑制等危害。印度梨形孢（）是于印度西北部塔尔沙漠中发现的一种植物根系内生真菌，具有促进植物地上部和根系的生长、增强养分吸收、提高宿主抗病性、增强植物对生物和非生物胁迫的抗性和耐受性等优点。印度梨形孢在形态与功能上均与传统的丛枝菌根真菌极为相似，不同之处在于，印度梨形孢可以在人工培养基上进行离体培养，而丛枝菌根真菌只能寄生于活体植物的根部。目前已有大量研究表明印度梨形孢通过强化植物对重金属的转运、富集及根系稳定化过程来降低土壤重金属污染程度，并通过促进营养物质的吸收利用、提高植物体内的抗氧化水平、调控抗逆性相关基因的表达、根系排泄调控和改善根系微生物生态环境等方式提升寄主植物对重金属的抗逆性。

高丹草（）具有生长速度快、根系发达、地上生物量大的特点，高丹草不仅具有耐贫瘠、耐盐碱等优良抗性，还被用于Cd污染土壤的修复研究，是在环境修复和资源开发利用方面具有广阔应用前景的生态修复植物。但对高丹草和菌根共生效应的研究还较少，印度梨形孢对高丹草的作用机制尚不可知。

基于此，本研究拟通过水培实验，探究印度梨形孢在不同Cd浓度（0、5、10、30、50、100 mg·L）下对高丹草幼苗生长和吸收积累重金属的影响，分析印度梨形孢对重金属Cd胁迫下高丹草生长和生理特性以及重金属Cd在高丹草植物体内转运、富集和分布特征的影响，以期为印度梨形孢广泛应用于植物抗逆性的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试草种高丹草为高粱与苏丹草杂交的一年生草本植物。供试菌种印度梨形孢（，简称P）由山东省林业科学研究院提供，后于山东农业大学林学院实验室进一步培育使用。

1.2 试验设计

试验在山东农业大学林学实验站的温室大棚内进行。挑选颗粒饱满的高丹草种子，用3%的次氯酸钠浸泡20 min 后，用去离子水冲洗3 遍，再用70%乙醇消毒20 min，去离子水冲洗3 遍之后均匀播种到铺满蛭石的种植槽内，待种子萌发生长一个月后进行移苗，挑选生长健壮和长势一致的幼苗放入水中，缓慢冲洗掉蛭石，用定植棉固定移栽到含有1/2 霍格兰营养液的水中，以5 株幼苗为一个样，重复3 个样，设置两组处理，每组设置6 个Cd 浓度。水培生长一周后，待植株完全适应了水培环境，在接菌处理组（记作P+）的水培基质中加入印度梨形孢悬浮液，每升水含3 g印度梨形孢菌丝，对照组（记作P-）不做处理，2～3 d更换一次水和补加菌液。待印度梨形孢在植株体内定殖25 d后，将根部有印度梨形孢定殖与未定殖的植株苗转移到清水中，以营养液补充营养。而后加入重金属标样，使两组培养液中Cd 浓度分别为0、5、10、30、50、100 mg·L，以未加重金属的植株作为空白对照。

1.3 指标测定

待印度梨形孢在高丹草体内定殖25 d后，使用台盼蓝染色法观察印度梨形孢在高丹草体内的定殖情况。Cd 胁迫7 d 后，用直尺测量株高，记录叶片数和黄叶数，采集新鲜叶片测定生理指标。生理指标的测定均以鲜质量计，可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定；可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量采用蒽酮法测定；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定；过氧化物酶（Peroxidase，POD）含量采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶（Catalase，CAT）含量采用分光光度计法测定；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）含量采用NBT 光还原法测定。同步采集根茎叶样本在105 ℃杀青，75 ℃烘干后记录生物量，最后将各组织样品粉碎过筛后用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）测定植物不同部位Cd含量，ICP分析条件参数设置为分谱线波长214.3 nm、射频功率1 150 W、雾化器流速1.00 L·min、辅助器流速1.50 L·min、等离子体流速15.0 L·min。分别计算转移系数和富集系数，计算公式如下：

转移系数（transport factor，TF）=地上部Cd 含量/根部Cd含量

富集系数（biological concentration factor，BCF）=植物Cd含量/营养液Cd含量

1.4 数据处理

所有数据均为3 个重复的平均值±标准差，采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据统计分析，采用Origin 9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢在高丹草根系的定殖

印度梨形孢与高丹草共培养25 d后，印度梨形孢与高丹草成功定殖，且印度梨形孢的厚垣孢子主要集中在高丹草侧根两侧和主根根端部分，通过图1 可以看出，印度梨形孢在高丹草根部大量定殖，数量多且分布密集，二者成功建立共生关系。

图1 高丹草根系侵染状况（100×）Figure 1 Root infection status of S.Hybrid Sudangrass（100×）

2.2 印度梨形孢对高丹草生长的影响

不同Cd浓度下高丹草的生长状况存在差异，低浓度（5 mg·L）处理下与CK 相一致，100 mg·L浓度下生长最差（图2），而在同一Cd浓度处理下，接种印度梨形孢的高丹草生长状况优于不接种处理的（图3）。

图2 不同Cd浓度下高丹草的生长状况Figure 2 The growth of S.Hybrid Sudangrass under different Cd concentrations

图3 同一Cd浓度下高丹草不同处理的生长状况Figure 3 Growth conditions of S.Hybrid Sudangrass under different treatments at the same Cd concentration

由表1 可知，随着Cd 浓度的增加，高丹草不接菌组与接菌组叶片数和生物量无显著差异（＞0.05），但整体生物量接菌组高于不接菌组，0、5、10、30、50、100 mg·L的Cd 浓度处理分别比对照组高17.85%、19.51%、0%、29.7%、10.61%、9.65%。随着Cd 浓度的增加，高丹草接菌与不接菌组株高、叶片数、干质量降低，黄叶数增加。在0～30 mg·LCd 浓度下，两组黄叶数差异不明显（＞0.05），在高浓度50 mg·L和100 mg·L下，接菌组分别比对照组分别降低49.8%和42.2%，接菌显著降低了高丹草的黄叶数。

表1 Cd胁迫与印度梨形孢接种对高丹草生长的影响Table 1 Effects of Cd stress and Piriformospora indica on the growth of S.Hybrid Sudangrass

2.3 印度梨形孢对Cd 胁迫下高丹草地上部抗性生理指标的影响

2.3.1 印度梨形孢对Cd 胁迫下高丹草渗透调剂物质的影响

由图4 可知，随着Cd 浓度的增加，高丹草接菌组与对照组可溶性蛋白含量先增加后降低，且在不同Cd浓度下，接菌组与对照组可溶性蛋白含量存在极显著差异（＜0.01）。接菌提高了高丹草可溶性蛋白含量，在0、5、10 mg·L下，含量 分别 提高 了22.74%、57.59%、5.37%，在中高浓度30、50、100 mg·L下提高显著，分别增加了110%、52%、351%，说明在高浓度下印度梨形孢通过调节渗透调节物质来改善细胞膜受损的效果显著。

图4 Cd胁迫和接种印度梨形孢对可溶性蛋白含量的影响Figure 4 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on soluble protein content

接菌组和未接菌组可溶性糖含量随着Cd浓度的增加呈波动上升趋势（图5），且两组可溶性糖含量存在显著差异（100 mg·L除外）。在0、5、10、30、50 mg·L的Cd 浓度下，接菌组比对照组分别提高了33%、14.7%、6.9%、15.7%、29.2%，但在100 mg·LCd浓度下无显著差异（＞0.05）。

图5 Cd胁迫和接种印度梨形孢对可溶性糖含量的影响Figure 5 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on soluble sugar content

随着Cd 浓度的增加，高丹草叶片丙二醛含量呈上升趋势（图6），在0、5、10、30、50 mg·LCd浓度下含量增加不显著（＞0.05），在100 mg·LCd 胁迫下，丙二醛含量明显上升，且接菌组植株含量低于未接菌组，在0、5、10、30 mg·L接菌组比未接菌组分别减少19.2%、15.8%、14%、21.7%。在50 mg·L接菌组比未接菌组增加14.2%，在100 mg·L又减少49.4%。说明高丹草在高浓度Cd 胁迫下，植株细胞膜透性受到严重伤害，接种印度梨形孢后缓解了Cd 对植物的伤害，增强了细胞膜透性。

图6 Cd胁迫和接种印度梨形孢对丙二醛含量的影响Figure 6 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on malondialdehyde content

2.3.2 印度梨形孢对Cd胁迫下高丹草酶活性的影响

随着Cd浓度的增加，两组处理过氧化物酶活性呈递减趋势（图7）。在无Cd胁迫处理（0 mg·L）下，接菌与不接菌组过氧化物酶活性无显著差异（＞0.05），随着Cd 浓度的增加，两组之间存在极显著差异（＜0.01），在5、10、30、50、100 mg·L浓度下，接菌后高丹草叶片过氧化物酶活性分别提高了1.51、0.24、1.21、0.42、1.6倍。

图7 Cd胁迫和接种印度梨形孢对过氧化物酶活性的影响Figure 7 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on peroxidase activity

不同Cd 浓度处理下，高丹草接菌组与不接菌组超氧化物歧化酶活性呈先增加后降低趋势（图8）。在不接菌处理下，5、10、30、50、100 mg·LCd 胁迫下高丹草超氧化物歧化酶活性比不加Cd 处理（0 mg·L）分别增加了13.5%、37.8%、44.6%、22.3%、1.09%。接菌提高了高丹草叶片超氧化物歧化酶活性，在0、5、10 mg·LCd 浓度下增加不显著（＞0.05），在30、50、100 mg·LCd 浓度下增加显著（＜0.05），分别提高了12.1%、27.7%、10.94%。

图8 Cd胁迫和接种印度梨形孢对超氧化物歧化酶活性的影响Figure 8 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on superoxide dismutase activity

随着Cd浓度的增加，高丹草叶片过氧化氢酶活性先增加后降低（图9）。在不同Cd浓度下，接菌组与不接菌组含量差异显著（10、30 mg·L除外）。0、5、10、30、50、100 mg·LCd处理接菌组比不接菌组分别增加52.17%、30.3%、1.38%、17.7%、21.2%、47.05%。在Cd浓度为30 mg·L时含量达到最高，之后随着浓度的增加过氧化氢酶活性降低，在100 mg·L时达到最低值。

图9 Cd胁迫和接种印度梨形孢对过氧化氢酶活性的影响Figure 9 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on catalase activity

2.4 印度梨形孢对高丹草体内Cd 的转运、富集和分布特征的影响

由表2 可知，高丹草各组织对Cd 的积累和分配存在显著差异（＜0.05）。高丹草体内Cd 含量总体呈现出根＞叶＞茎的分布。在不接菌情况下，高丹草根、茎、叶中Cd 含量随着浓度增加而增加，5、10、30、50、100 mg·L处理下高丹草根部Cd 含量比不加Cd分别增加15.25、54.5、105、328.25、560 倍。接菌后高丹草根部Cd 含量增加，在5 mg·L和30 mg·L浓度下，接菌组与不接菌组根部Cd 积累量差异明显（＜0.05），接菌后分别增加了66.1%和75.11%，高Cd浓度（50、100 mg·L）下二者无明显差异（＞0.05）。在5 mg·L和30 mg·LCd 浓度下接菌组和不接菌组茎部Cd 含量差异不显著，在10、50、100 mg·LCd 浓度下，接菌组茎部Cd含量显著低于不接菌组，分别减少了35.7%、42.2%、15.8%。在5、10、30、100 mg·LCd 浓度下，接菌显著减少了叶片Cd 的积累，和不接菌相比，分别减少了16.7%、61.9%、42.1%、40.6%，在50 mg·LCd 时增加7.9%，可能是误差引起。不同浓度和不同处理下高丹草富集系数呈波动变化，在5 mg·LCd 浓度下，接菌组比不接菌增加了33.6%，10 mg·LCd 浓度下降低10%，30 mg·LCd 浓度下增加50%，50～100 mg·LCd 浓度下降低1%～4%。不同处理和不同Cd 浓度下高丹草的转移系数存在差异，且在不同Cd 浓度下，接菌组转移系数显著（＜0.05）低于对照组（50 mg·LCd 除外），0、5、10、30、50、100 mg·L处理下分别降低了81.5%、61.2%、39.5%、63%、22.2%、27.3%，说明随着Cd 浓度的增加，高丹草由根部向地上部转移Cd 的能力减弱，接菌后印度梨形孢将大部分Cd 聚集到植物根部，限制其向地上部转移，从而减少Cd 在地上部的积累，减轻重金属Cd对植物地上部的毒害。

表2 Cd胁迫和接种印度梨形孢对高丹草体内Cd的转运、富集和分布特征的影响Table 2 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on the transport，enrichment and distribution characteristics of Cd in S.Hybrid Sudangrass

3 讨论

Cd 影响植物的生长发育，对植物的生长表现出低促高抑的效果，不同物种和品种表现出不同的效果。当Cd 浓度超出植物所能承受的最大范围时，植物则表现出植株矮小、生长缓慢、生物量下降甚至死亡。本研究结果表明，在低Cd 浓度下，高丹草能够正常生长，叶片数和株高均有一定程度的增加，这与前人的研究结果相似。随着Cd浓度的增加，高丹草的生长状况变差，叶片发黄，积累的生物量减少，说明高浓度Cd 胁迫对高丹草产生明显的毒害作用，这与前人的研究结果一致。接菌后高丹草黄叶数减少，生物量提高，叶片数增加，说明接种印度梨形孢后其生长状况得到明显改善，接菌缓解了Cd 对高丹草生长的抑制作用。

印度梨形孢提高了Cd胁迫下高丹草的抗性生理指标。植物在遭受Cd 胁迫时，积累的Cd 离子在植物体内活动，导致植物体内产生大量活性氧，破坏了体内活性氧平衡，导致细胞氧化受损，从而抑制植物的生长，植物体内的保护酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等）通过改变自身活性来清除多余的活性氧，从而维护植株正常生长。NANDA 等对铜胁迫下决明子的研究表明，印度梨形孢通过增强超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的酶活性显著改善了抗氧化防御系统。此外，除了增强保护参数外，它还降低了过氧化氢含量、脂质过氧化和DNA 损伤等破坏性参数。本研究结果表明，随着Cd浓度增加，高丹草体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性先增加后降低，而过氧化物酶活性随着Cd 浓度的增加而降低，说明高丹草主要通过调节超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性来抵抗Cd胁迫的伤害，在高浓度下，高丹草体内的抗氧化酶的调节能力降低导致酶活性降低。接菌后过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均有所提高，说明接种印度梨形孢能够通过提高抗氧化酶活性来抵御不良环境。丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化能反映植物在逆境环境下生物膜的受损程度，丙二醛含量越高说明生物膜受损越严重。在本研究中，高丹草丙二醛和可溶性糖含量随着Cd 浓度的增加而增加，可溶性蛋白先增加后降低，接菌降低了高丹草叶片中丙二醛含量，提高了可溶性糖和可溶性蛋白含量，说明随着Cd浓度的上升，植物生物膜受损严重，接菌通过降低丙二醛含量，提高渗透调节物质来减轻Cd 对植物生物膜的损伤，这与前人有关印度梨形孢接种和Cd胁迫下植物生理响应的研究结果一致。

YAGHOUBIAN 等研究发现，印度梨形孢在0～100 mg·L的Cd溶液中具有较高的去除效率，且浓度的增加会抑制印度梨形孢对Cd的积累。印度梨形孢细胞壁能够吸附重金属，通过将重金属固定在植物根系的表皮层和皮层，降低了对根系皮层细胞的损害，减少了重金属进入中柱细胞，从而减少了植物通过维管束将重金属向地上部的运输。SALEH 等对向日葵的研究表明，在Cd 胁迫下接种印度梨形孢通过向根部积累更多的Cd以减少重金属向植物地上部的移动。也有对决明子的研究表明，印度梨形孢通过抑制铜从根部向地上部转移，减轻了铜对决明子的毒害作用。本研究中，Cd 在高丹草不同部位的积累呈根＞叶＞茎的分布，在不同Cd 浓度下，高丹草接种印度梨形孢后和未接菌相比地下部Cd 含量增加，地上部Cd含量降低，转移系数也降低，这说明印度梨形孢通过将大部分Cd 离子固定在植物的根部，从而减少了向高丹草地上部的转移，减轻了Cd对高丹草的毒害，提高了高丹草的耐性。

综上，在Cd 胁迫下添加印度梨形孢菌剂通过促进高丹草根系对Cd 的吸收和累积，抑制重金属Cd 向地上部的转移，减轻膜过氧化损伤，调节渗透调节物质和提高抗氧化酶活性来减轻Cd对高丹草生长的抑制作用和毒性损伤。印度梨形孢具有环保、高效且容易在体外繁殖等优点，具有巨大的应用前景。在重金属污染地区的生态恢复中可考虑采用印度梨形孢和植物共生的互作体系，但生长条件与环境因子均会对印度梨形孢与植物互作产生影响。印度梨形孢与宿主植物的互作机制，印度梨形孢提高宿主植物抗逆性相关基因的表达，以及高质量菌剂和生物菌肥的生产等均有待进一步的研究。

4 结论

（1）低浓度（5 mg·L）Cd 对高丹草的生长具有促进作用。随着浓度的增加，高丹草株高、叶片数减小，生物量降低，黄叶数增加，生长受到抑制，接种印度梨形孢后能够促进高丹草生物量的积累，缓解叶片发黄现象，改善生长状况。

（2）接种印度梨形孢提高了Cd 胁迫下高丹草的抗性生理指标。随着Cd 浓度的增加，高丹草未接菌组的可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性总体上逐渐升高，过氧化物酶活性逐渐降低。接种印度梨形孢提高了可溶性蛋白、可溶性糖含量以及酶活性，降低了丙二醛含量。印度梨形孢通过调节渗透调节物质和提高抗氧化酶活性来抵御Cd胁迫对高丹草的伤害。

（3）不同Cd 浓度条件下，高丹草体内Cd 含量分布呈根＞叶＞茎，且含量随着Cd浓度增加而增加，接种印度梨形孢后高丹草地下部Cd 含量增加，地上部Cd含量降低，接种印度梨形孢减少了Cd 从地下部向地上部的转移，减轻了Cd对高丹草地上部的毒害。