糯米山药炭疽病病原菌的分离·鉴定与生物防治

张呈念，黄哲鸿，王科晶，华树妹，涂金文，张杨文，陈仕朋*

(1.文成县现代农业与康养产业研究院，浙江温州 325000；2.三明市农业科学研究院，福建三明 365050；3.慕恩(广州)生物科技有限公司，广东广州 510700)

山药 (L.)，别名薯蓣、参薯、大薯、田薯等，属于薯蓣科 (Dioscoreaceae) 薯蓣属 ()一年或多年生缠绕性藤本植物，其利用部位为根状或块状茎，山药除食用功能外还有补脾、养肺、固肾等保健功效。我国山药种植面积常年稳定在33.33万hm左右，分布区域遍布全国，许多地方的山药品种已形成区域品牌，如河南温县铁棍山药、湖北武穴佛手山药、江西瑞昌山药、福建清流雪薯、福建山格淮山、浙江文成糯米山药等。文成糯米山药以其糯性为主要特色，全县近年种植面积为400.00～533.33 hm，平均产量30 t/hm，市场销售价达16元/ kg，产值高达48万/hm，成为文成县农业特色产业，也被文成县作为乡村振兴的有力助手。但文成糯米山药抗病能力弱，炭疽病的发生尤其严重，一般造成减产20%～30%，严重时达50%以上，甚至绝收。炭疽病是山药的主要病害，各地山药炭疽病的病原菌存在差异，林永康从福建沙县山药病叶分离的致病菌为辣椒炭疽菌 () ，黄婷从江西瑞昌山药的病叶中分离出胶孢炭疽菌 ()，韩晓勇等从江苏六合山药病叶中分离到胶孢炭疽菌与暹逻炭疽菌 ()。目前文成糯米山药炭疽病的相关研究仍未见报道，因此分离鉴定糯米山药病原菌是精准防控其炭疽病的首要课题。目前山药炭疽病防治以化学防治为主，在生产上常用防治药剂有70% 甲基硫菌灵、50% 烯酰吗啉、30%苯醚甲环唑乳油、50%氯溴异氰尿酸、75%拿敌稳等，然而化学农药的频繁施用不仅造成食品安全问题而且破坏土壤生态。生物防治具有绿色、生态、高效、安全等特点。Palaniyandi等用具有生防能力的链霉菌防治山药病害取得良好效果；李华用地衣芽孢杆菌防治辣椒炭疽病，防治效果可达68.1%；冯江鹏等用贝莱斯芽孢杆菌防治草莓胶孢炭疽病，预防效果达95%以上。哈茨木霉菌已被应用于多种植物病害的生物防治，Brito等研究表明木霉对芒果青枯病具有良好的防治效果；Swehla等研究表明，哈茨木霉的分离物对菜豆根腐病病原菌具有抑制作用；Li等研究发现大白菜接种哈茨木霉后，可降低大白菜马蹄根病的发生率。宋光桃从油茶根际土壤中分离出3株木霉菌，其对油茶炭疽病抑菌效果较明显。笔者分离了糯米山药的炭疽病原菌，通过形态学和rDNA-ITS序列对病原菌进行鉴定，同时探究其生长适应条件，验证可用于糯米山药炭疽病生物防治的哈茨木霉菌生防菌剂，并开展田间药效试验，探明糯米山药炭疽病病原菌的菌属、生存条件以及挑选抑制炭疽病发生的生物防治，以期为文成糯米山药的绿色生物防治提供有效措施和理论依据。

1 材料与方法

2019年7月从浙江文成县沙垟采集糯米山药呈典型炭疽病病状的病叶样品，样品采集后立刻进行病原菌分离。

通过常规分离法分离病菌，将PDA平板置于28 ℃培养箱中进行培养。待菌落长成，挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化，并在显微镜下观察其孢子形态。

将分离纯化的病原菌接种至PDA平板培养基，3 d后观察菌丝形态特征，并镜检分生孢子形态，参考东秀珠等的方法。

采用 CTAB 法提取病原菌DNA，采用真核生物通用引物扩增rDNA-ITS序列 (ITS5：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应在50 μL体系中进行，依次加入以下试剂：ITS5(10 μmol/L) 0.5 μL,ITS4(10 μmol/L) 0.5 μL,DNA 模板1 μL,2×PCR Master Mix 25.0 μL,ddHO 23.0 μL，混匀后按如下程序进行 PCR 扩增：95 ℃预变性10 min，5 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环， 最后一次循环后，72 ℃ 10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，回收产物交由铂尚公司进行测序，获得的序列上传到 NCBI Genbank 数据库，同时进行序列同源性分析。

将供试菌株接种到PDA平板上培养7 d后，用无菌水冲洗分生孢子，用血球计数板配制1×10个/mL孢子悬浮液。采未转绿的新鲜山药嫩叶，用灭菌水将叶片表面冲洗干净，晾干之后，用75%乙醇擦拭，待叶片表面残留的水干之后，吸取5 μL孢子液，滴加于叶片上，放置于水琼脂培养皿保湿并在室温下等待其发病。

探究温度及pH对分离菌株生长的影响，测定方法：将分离菌接种于pH为5.7的PDA培养基，并放置于25、30、35、40、45 ℃下，6 d后观察并记录菌落直径。配制PDA培养基pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12，接种菌株放置温度为30 ℃的培养箱在第6天进行观察，并记录菌落的直径。

采用平板对峙法，选取哈茨木霉菌株Th7和Th19(慕恩(广州)生物科技有限公司提供)对所分离的炭疽菌进行拮抗试验。分别记录拮抗3和9 d的菌落直径，并计算抑制率。

2020年设置长9 m、宽1 m的糯米山药，3个重复，以喷施水处理作为CK，对株高50 cm的山药幼苗叶片喷哈茨木霉Th7(样品由慕恩(广州)生物科技有限公司提供)300倍稀释液,叶片正反两面喷施至叶面滴水，间隔15 d喷施一次，于2020年6月15日和8月15日按5点取样法对文成糯米山药进行病害调查，记载病情指数和计算防治效果。病害分级标准：0级，无病斑；1级，叶面的病斑面积占整个叶面积5%以下；2级，叶面的病斑面积占整个叶面积6%～10%；3级，叶面的病斑面积占整个叶面积11%～25%；4级，叶面的病斑面积占整个叶面积26%～50%；5级，叶面的病斑面积占整个叶面积50%以上。计算公式：

用SPSS 23.0进行方差分析与student t-test检验，用Excel 2016处理数据和绘图，通过MEGA 7构建系统发育树。

2 结果与分析

图1为采集的文成沙垟村与二源村种植的糯米山药病叶，病斑的中心为褐色向外圈扩展至灰黑色，呈同心圆，是典型的炭疽病病叶的病斑特征。

图1 糯米山药炭疽病病叶Fig.1 Anthracnose leaf of glutinous yam

从采集的病叶中分离出3个表型明显不同的菌株，命名为WC01、WC02、WC03，在PDA平板培养基上进行培养及形态学鉴定(图2)。WC01菌落从中间逐渐变为灰色，菌丝直径为7 cm，边缘会产生橘红色的孢子团，菌落中间正面为灰色，外缘为黄色，呈同心状分布，分生孢子白灰色，形状为长椭圆至纺锤形，单孢，两端钝圆，长度为(10.2～12.1)μm×(2.0～4.0) μm；WC02菌落由白色菌丝从中间逐渐变为浅灰色，待菌丝长满盘直径为9 cm，背面为灰褐色，菌丝紧致，边缘光滑，分生孢子为无色长椭圆形，单孢，大小为(6.6～10.2)μm×(2.2～4.0) μm；WC03的菌落白色菌丝向四周扩散，菌丝直径为6 cm，从中间向四周变为灰绿色。菌丝紧致，边缘白色光滑，分生孢子无色长椭圆形，单孢，大小为(4.70～6.35) μm×(1.60～2.00)μm。这3株菌的菌落形态与spp.相似。

提取3个菌株基因组DNA，并通过PCR扩增病原菌rDNA-ITS序列，分别扩增获得578、601和571 bp，并将基因序列登录GenBank(登录号WC01:MW221348，WC02:MW221823，WC03:MW221353)，通过NCBI网站的Blastn比较3株病原菌DNA相似度，发现WC01、WC02、WC03分别与CMUBE812、ICMP 17919、ICMP 17919最为相似，相似度分别达96.53%、99.66%与98.21% (表1)。

图2 PDA培养基培养分离菌株第14天的生长情况与形态Fig.2 Growth and morphology of the isolated pathogens on PDA medium on the 14 th day

将WC01、WC02和WC03的ITS序列同GenBank比对的同源性最高的29个序列用MEGA7软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。根据发育树可以发现，WC01、WC02和WC03与ICMP 17919处于同一分支内(图3)。

表1 菌种ITS-DNA比对Table 1 ITS-DNA comparison of strains

遵循柯赫氏法则，将糯米山药病叶分离鉴定到的3株病原菌，回接糯米山药嫩叶验证其致病症，均表现出明显的炭疽病症，其中WC03致病性最强(图4)。进行再次分离后，通过ITS序列验证为同一菌株。因此可以确定分离的3株菌株均为炭疽病病原菌。

测定pH和温度对病原菌生长状况的影响，了解病原菌生长所需的环境，从而进行预防和发病预警。不同温度条件下，3个菌株均最适合生长于30 ℃，观察培养基中的菌丝，发现30 ℃的菌丝生长最为密集，菌丝量最多，温度大于30 ℃不利于菌丝的生长， WC01和WC02的菌丝生长速度均显著快于WC03(图5)。此外温度为30 ℃时，炭疽病菌株会产生更多的孢子(图6)；当pH为5～9时，WC01的菌落直径显著大于其他pH的菌落直径；当pH为4～11时，WC02的菌落直径显著大于pH为12的菌落直径；当pH为4～10时，WC03的菌落直径显著大于pH为11和12时的WC03菌落直径，3株菌株的菌落直径在各pH下无显著差异，在pH为12时，生长均受到抑制(图7)。

采用平板对峙法鉴定2株哈茨木霉菌Th7和Th19对于WC01的拮抗作用(图8)。由表2可知，在接种第3天时，Th7和Th19对于3株炭疽病病原菌均有抑制作用，Th7对3株炭疽病病原菌的抑制率在9.4%～12.73%，Th19对3株炭疽病病原菌的抑制率则在11.28%～27.27%。在接种第9天时，2株木霉对于炭疽病病菌都有良好的抑制效果， Th7对3株炭疽菌的抑制率均达100%，Th19对3株炭疽菌的抑制率也均达67%以上。表明哈茨木霉Th7的拮抗效果大于Th19。

图3 Colletotrichum spp.系统发育树Fig.3 Phylogenetic analysis of Colletotrichum spp.

图4 接种3株菌株的山药叶片Fig.4 Yam leaves inoculated with three isolated strains

注：不同小写字母表示同一温度不同菌株间差异显著(P<0.05);不同大写字母表示同一菌株不同温度下差异显著(P<0.05) Note:Different lowercase letters represent significant difference between strains;different capital letters represent significant difference between different temperatures图5 培养温度对病原菌生长的影响Fig.5 Effect of temperature on pathogens growth

进一步通过田间种植试验研究哈茨木霉Th7对糯米山药炭疽病的防治效果，每隔15 d施用一次。田间试验结果表明，施用30 d后， Th7对于山药炭疽病有显著的防治效果，且从田间的病叶图中看到经过木霉处理的病斑聚为一个小斑点，并不会扩散到整个叶片，而CK处理的叶片病斑扩大并占据整个叶片的27% (图9a)。病情指数分析发现Th7处理的病情指数显著低于CK处理，说明施用30 d木霉菌能防止炭疽病对山药的入侵。木霉菌Th7施用90 d的病情指数仍显著低于CK处理 (图9b)，整体防治效果为49.72% (图9c)。

图6 25和30 ℃下3株分离菌株在PDA培养基上的产孢情况Fig.6 Spore production of three isolated strains on PDA medium at 25 and 30 ℃

注：不同小写字母表示同一pH不同菌株间差异显著(P<0.05);不同大写字母表示同一菌株不同pH下差异显著(P<0.05) Note:Different lowercase letters represent significant difference between strains;different capital letters represent significant difference between different pH values图7 pH对病原菌生长的影响Fig.7 Effect of pH on pathogens growth

3 讨论与结论

炭疽病为山药产区的重要病害，目前研究表明在我国各地炭疽病的致病菌有所不同，该研究从糯米山药病叶上发现并分离了3株炭疽病菌株并验证其致病性。研究炭疽病病原菌的生长条件对于防治炭疽病起着重要作用。刘爱媛等研究表明，荔枝炭疽病菌丝适合的生长温度为8～38 ℃，产生孢子的温度为12～36 ℃；曾思海等对杉木球果炭疽病的研究表明，该病菌生殖生长的温度为22～30 ℃；该研究从糯米山药所分离的炭疽病适合的生长温度为25～30 ℃，最适合产孢的温度为30 ℃，该结果与唐景美等从辣椒中分离出辣椒胶孢炭疽菌的生物学特性相似。不同属的炭疽病的生理特性有所不同，可以根据该菌的生理特性在环境温度达到其适合生长之前预警和防治，对于糯米山药炭疽病的防治应在夏初，在病原菌暴发前期防治可以取得更好的预防效果。木霉菌在作物病害的生物防治中具有广泛的应用。

图8 木霉Th7与WC01的平板拮抗试验Fig.8 Plate antagonistic test between Trichoderma Th7 and WC01

表2 哈茨木霉Th7和Th19对3株炭疽病病原菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effects of Trichoderma harzianum Th7 and Th19 on three Colletotrichum strains

王学坚等研究表明，钩状木霉菌YMF1.00247的发酵液能显著增加烟草的株高、叶片、茎围等生理性状，促进烟草的生长，且能减少烟草黑茎病的发病率；马丽婷等发现木霉菌能抑制石榴枯萎病且抑制率在60%～70%；陆美珍等筛选出的木霉菌T6对于美洲南瓜枯萎病病原菌抑制率达85.7%；该试验中的哈茨木霉菌Th7在第9天时对山药炭疽病病原菌的抑制率达100%，Th19的抑制率在67%以上，表明哈茨木霉菌对于文成山药炭疽病病原菌具有较高的抑制效果。朱洪江等发现木霉菌对于烟草青枯病的田间防治随着时间增长，防治效果越弱，这可能是由于田间环境的影响和生防菌株自身适应性的影响。该研究中，增加处理时间防治效果也随之增加，说明施用90 d的木霉菌比施用30 d防治效果更好。因此，可以适当延长或增加施用木霉的时间与次数来增加防控效果。

近年来，国内开展了各种作物炭疽病的生物防治研究，筛选了芽孢杆菌()、抗生素溶杆菌()、荧光假单孢杆菌(sp.)等生防菌用于炭疽病的防治。木霉菌作为新型的生防菌已被用于多种作物病害的防治，如烟草黑胫病、辣椒立枯病、黄瓜灰霉病等真菌、细菌病害的防治，但木霉菌应用于山药炭疽病防治尚未见报道。该研究通过平板对峙法和田间防治，发现木霉菌Th7对于文成糯米山药炭疽病具有较好的防治效果，为文成山药炭疽病的防治提供了一定的理论依据，但其具体的生防机制还需要进一步探究。

注：a、b、c分别为施用木霉Th7后30 d炭疽病症状、病情指数和总体防治效果。*表示不同处理间差异显著(P<0.05) Note：a,b,c were anthracnose symptoms 30 d after applying Th7,disease index and control effect.* indicated significant difference between different treatments at 0.05 level图9 哈茨木霉Th7田间防治效果与病害分析Fig.9 Field effect and disease analysis of Trichoderma harzianum Th7