交叉学科建设中气质联用技术实验课程的设计

杨 晨，颜 军，何 钢，任凤英，梁 立，鲁 兰

（成都大学药学院，药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，成都 610106）

0 引言

不同学科间的交叉融合，多技术跨界交联将不断催生新学科、新技术和创新成果。在高校实验课程开展过程中，多学科交叉融合不仅可以拓展学生知识面，更能激发学生自主学习意识，提高实验中创新能力，更能推动学院间学科协同发展从而培养出复合型人才［1-6］。

生物信息学作为当今生命科学和自然科学重大前沿领域之一，是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。生物信息学作为一门实践性很强的学科，需要从网络信息中获取大量实验数据，因此对学生的计算机操作能力和数据分析能力显得十分重要。通过生物信息学技术，可以去探索基因如何形成代谢通路控制复杂生命现象和行为［7-12］。仪器分析作为化学学科重要分支，是以物质理化性质为基础建立的一种分析方法。气相色谱质谱联用技术（GC-MS）以其灵敏度高的优点，可检测到大量低含量小分子物质。目前已成为微生物功能基因组代谢表型研究的常规分析技术。GC-MS在色谱分析重复性、分辨率和质谱裂解碎片重复性方面具有明显优势，因此可以选择性地富集和检测大量代谢物中痕量物质，表型代谢通路中参与各种反应的化学物质，使其在代谢组学基础上更好地评估生命系统。

结合生物、药学学科特点以及研究生科研项目需求，本实验以生物信息学技术结合GC-MS对铜绿假单胞菌胞内代谢物进行定性分析，通过实验设计使学生掌握气质联用仪工作原理，熟悉生物信息数据挖掘方法和化合物定性分析检测技术。

1 实验教学方案

1.1 实验教学设计

本实验面向生物专业、药学专业本科生及一年级药物分析学研究生开设。实验内容设计要在学生掌握基本知识与技能基础上，提高学生在实验过程中的主动性，挖掘实验分析结果的创造性。实验内容不仅包含数据挖掘分析，还涉及仪器分析中气相色谱质谱联用法的应用，因而实验课程分为生物信息学数据挖掘及代谢产物定性鉴别两部分构成。本实验以大型精密仪器为教学平台，结合微生物样本和学科前沿内容而开设，有利于充分建立不同学科专业知识间联系，体现学科之间交叉性，提高学生实践能力。

1.2 实验基本原理

基因表达的综合性（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库是生物信息学发现的重要基础，它接收和管理各研究机构提交的基因芯片或测序技术获得的不同生理、病理状态等基因表达数据。实验选取GSE65882 数据芯片和GPL84（Affymetrix Pseudomonas aeruginosa Array）平台，利用GEO2R 在线分析工具比较芯片中两组样品，以鉴定在整个实验条件下差异表达基因［13］。获得的大量差异表达基因通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）数据库，利用富集分析筛选与研究相关信号通路，为后续生物学实验提供思路。

GC-MS主要由气相色谱-接口-质谱仪组成。样品经进样口高温雾化后进入毛细管色谱柱，利用不同组分在两相间吸附能力、分配系数等不同性质使不同组分得到分离。分离后各组分通过毛细管柱直接连接法进入质谱仪。质谱仪主要由离子源、质量分析器和检测器3 部分构成。电子轰击电离源（EI）作为应用最广泛的一种离子源，其电离效率高、能量分散小、结构简单、操作方便；得到的特征性质谱图对化合物结构鉴别和解析十分有利。质量分析器将电离室中离子按质荷比（m／z）大小分开进入检测器，最后在检测器将离子束转变成放大后的电信号。计算机将采集到的每个质谱的所有离子相加得到总离子强度，其随时间变化形成的曲线作为总离子流色谱图（TIC），从而推断每个色谱峰分子结构相关信息。

由于GC-MS适用于分离分析具有挥发性物质，对挥发性低、热稳定性差的物质不能直接进样分析，因而常对样品进行衍生化反应，取代分子中的活泼氢来降低化合物极性。硅烷化反应在GC分析中常用来对样品进行前处理，化合物中羟基或氨基上活泼氢与硅烷化试剂中的烷基硅烷基发生交换，形成烷基硅烷基产物。常用的硅烷化类型有三甲基硅烷化（-TMS）和叔丁基二甲基硅烷化（-TBDMS）。烷基硅烷基产物其极性减弱，被测能力增强，热稳定性提高而有利于GCMS对其分离分析。各产物经国家标准技术研究所（NIST）数据库进行鉴定后，通过KEGG数据库验证差异表达基因信号通路富集分析结果。

1.3 实验仪器和材料

（1）实验仪器。Clarus SQ8 气相色谱-质谱联用仪（美国珀金埃尔默公司）、AS5150A 超声仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）、TGL-16B 离心机（上海安亭科学仪器厂）、XS205 精密电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

（2）实验材料。盐酸、吡啶、N，O-双三甲硅基乙酰胺（BSA）均由成都市科隆化学品有限公司提供、色谱乙腈（美国Fisher公司）；铜绿假单胞菌冻干菌丝体（由成都大学药学院临床药学实验室提供）。

1.4 实验步骤

（1）差异表达基因的筛选。采用GEO2R 在线分析工具（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／geo2r／）对GSE65882 数据芯片进行分析。4 个对照组样本（GSM1608059、GSM1608060、GSM1608061、GSM1608062）和6 个样品组样本（GSM1608067、GSM1608068、GSM1608069、GSM1608070、GSM1608071、GSM1608072）筛选铜绿假单胞菌差异表达基因，其中P＜0.05，＞1 的基因为差异表达基因。

（2）差异表达基因KEGG通路分析。将差异表达基因导入DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）数据库（http：／ ／david.ncifcrf.gov／）中进行KEGG 通路分析，以P＜0.05作为标准筛选得到铜绿假单胞菌KEGG关键信号通路［14］。

（3）样品的准备。精确称取菌丝体样品2 mg，加入100 μL 0.1% HCl-乙腈溶液。超声处理10 min后，加入100 μL BSA 和100 μL 吡啶。60 ℃反应30 min后离心，将上清液转移至进样小瓶中进行GC-MS分析。

（4）GC-MS 色谱条件。气相色谱采用PerkinElmer clarus680 系统，色谱柱为PerkinElmer Elite-5 ms毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱温箱初始温度设置为50 ℃，保持5 min 后以10 °C／min速度升温至180 ℃，随后以15 °C／min速度升温至300℃，保持5 min。进样口温度为200 ℃；不分流进样，进样体积1 μL；载气为高纯氦气，流速为1.5 mL／min。质谱采用PerkinElmer Clarus SQ8 MS 质谱仪，离子源为电子轰击离子源（EI）200 ℃，离子化能量70 eV；传输线温度220 ℃；扫描方式为全扫描；扫描范围50～500 amu。

2 结果分析与讨论

2.1 差异表达基因及KEGG通路分析

GSE65882 芯片利用GEO2R 工具共筛选出3 138个差异表达基因，其中2 199 个为上调基因，939 个为下调基因。3 138 个差异表达基因中筛选出含有标准基因名基因1 020 个，经KEGG富集分析，以P＜0.05为筛选条件，共得到13 个关键信号通路：代谢途径（Pae01100）、抗生素生物合成（Pae01130）、次级代谢产物生物合成（Pae01110）、氨基酸生物合成（Pae01230）、氧化磷酸化（Pae00190）、不同环境中微生物代谢（Pae01120）、碳代谢（Pae01200）、糖酵解／糖异生（Pae00010）、氮代谢（Pae00910）、嘧啶代谢（Pae00240）、柠檬酸循环（TCA 循环）（Pae00020）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（Pae00260）、氨基糖和核苷酸糖代谢（Pae00520），结果见图1。

图1 差异表达基因及其KEGG通路分析结果

2.2 GC-MS定性分析

采用GC-MS对样品中成分进行分析鉴定。通过NIST17 质谱数据库对各色谱峰进行鉴定。分离鉴定出的9 种氨基酸类化合物见图2 和表1。以横坐标为质荷比m／z，纵坐标为相对丰度，得到丙氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，116，147，190；缬氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，144，218；异亮氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，158，218，232；甘氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，147，174，248，276；丝氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，147，204，218，278；焦谷氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，147，156，230，258；苯丙氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，192，218；鸟氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，142，174；赖氨酸硅烷化反应后特征离子峰m／z＝73，128，156，174，230，317。以质谱峰的特征离子碎片作为定性依据，对样品进行定性分析，并让学生发现m／z＝73 或147 为三甲基硅烷基碎片特征峰，引导学生使用NIST17 数据库对未知化合物进行鉴定。

表1 鉴定出的9 种氨基酸类化合物

图2 9种氨基酸GC-MS总离子流色谱图与质谱图

通过鉴定出的9 种氨基酸类化合物，导入MBROLE2.0 数据库，以pseudomonas aeruginosa PAO1为生物背景进行KEGG 富集分析［15-16］。结果可得9种氨基酸都参与了代谢途径（Pae01100）过程。甘氨酸和丝氨酸同时参与了甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸（Pae00260）代谢过程。通过GC-MS 对各化学成分的定性鉴别，学生能将定性实验结果与生物信息学分析推论得到信号通路结合在一起，验证KEGG 信号通路富集结果的可靠性。同时，样品中其他未鉴定成分的定性分析，能激发学生对实验探索的兴趣。

3 教学实践要点

本实验课程是在微生物实验和仪器分析实验课程基础上而开设，由于本实验课程难点在于实验内容多，学科知识交叉广，并且大部分本科生以及一年级研究生对仪器设备接触较少，因此很难在短时间内理解并掌握仪器原理及操作，又能把实验结果与生物信息学分析结果紧密联系在一起。因此，本实验教学以“提出问题-解决问题-存在问题”为思路，利用思维导图构筑课堂笔记及实验记录，鼓励学生以实验小组为单位在有效时间内将课堂中原理内容和实验过程整体体现在思维导图中（见图3）。

图3 生物信息学与GC-MS实验原理思维导图

本实验教学过程中教师对生物信息学及GC-MS概念和原理进行讲解后，提出如何建立两者之间密切联系，如何将生物信息分析结果与仪器检测数据有机整合等问题。将以上问题带入实验过程中，利用GCMS采集得到9 种氨基酸类代谢产物与GSE65882 芯片差异表达基因富集的信号通路建立关联性，验证生物信息分析结果。同时，引导学生对其他未知代谢产物进行定性鉴定，利用代谢产物表征差异性探索与代谢相关的其他重要信号通路。实验完成后学生撰写实验报告，分析实验过程中存在问题，总结实验得失，对生物信息学及仪器分析知识要点进行归纳与总结，形成学科交叉关联网络图，并且在实验报告中，通过数据分析处理结果，建立学科之间关联性，对交叉学科实验心得体会进行探讨。

4 结语

在以前的学科实验教学中，学生实验内容较单一且仅局限与本学科知识的掌握，因此实验教学相对简单，内容单调，结果单薄，实验结果应用分析不强。交叉学科实验具有创新性、综合性、多样性等特点，能够培养出高层次、高素质复合型人才，因此在各大高校大力推进交叉学科人才培养。本实验教学正是基于生物信息学技术与气质联用技术，对铜绿假单胞菌胞内代谢物进行定性分析，通过GEO数据库筛选目标芯片获得差异表达基因，利用代谢物分析结果验证差异表达基因富集信号通路。本实验具有知识点多综合性强的特点，不仅能全面提升学生实验操作能力、丰富实验技能、扩充知识领域、提高科研能力，还能用于学生毕业实验设计，不但可以顺利完成毕业实验，而且让学生更多参与大型实验设计进行探索性及创新性实验，从而培养出符合社会需要的高素质复合型人才。