X射线致染色体结构畸变玻片标本制备的探索

宋国英，董 慧，朱美霖，贺 颖，唐 正，李 沛△

(1郑州大学基础医学院实验教学中心， 郑州 450001；2郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系； 3郑州大学基础医学院； △通讯作者)

实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养学生分析和解决问题能力、培训严密的思维方法和探索科学研究等方面具有不可替代的作用[1]。医学遗传学是高等医学院校的一门必修课，染色体结构畸变是遗传学实验教学中的重要实验之一，国内医学院校《医学遗传学实验指导》收录有染色体畸变观察章节。该实验包括染色体数目畸变和结构畸变观察。数目畸变有45XO、47XXY标本观察；染色体结构畸变包括缺失、重复、倒位、易位、插入、等臂染色体、微小体、染色单体断裂、缺失、环状染色体、双着丝粒染色体等。医学研究表明，染色体畸变是人类发生遗传病和出生缺陷的主要因素[2]。经文献查阅，现有的资料多见于临床上开展的染色体畸变检测类型，如平衡移位、插入、数目异常等分析，尚未见教学用关于双着丝粒、微小体、断片、环状染色体等染色体结构畸变玻片标本制备的报道，分析原因可能与标本制作技术有关，致使染色体结构畸变玻片标本稀缺。本中心购买有数目畸变标本，学生可以镜下直接观察，但染色体结构畸变玻片标本尚未见销售。因而该项实验教学仅以示教及模式图形式进行，这使得染色体结构畸变观察实验教学效果不理想。为满足实验教学的需求，作者开展本课题研究，探索诱导染色体结构畸变所需的X射线辐照最佳剂量，为常规制备染色体结构畸变玻片标本提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器和试剂包括6mvX射线(医科达牌直线加速器)，MIR-162型CO2培养箱(日本SANYO)，湘仪TDZ5-WS 型离心机，1640培养基(购自晖达)以及固定液、低渗液和 Giemsa染液(本实验室自配)。

1.2 方法

标本采集健康男性自愿献血者2例。献血者不吸烟，无有毒、有害化学物质和射线接触史(近6个月内)，无菌条件下肝素锂抗凝管采血4管，每管约2 ml，置直线加速器内照射。照射条件下：在直线加速器内距离100 cm 进行X射线照射，照射野10×10 cm,照射剂量分别为1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy，照射量率为6 Gy/min。照射结束后，实验人员将各剂量组0.6 ml全血接种在5 ml含血清1640混合培养基中，置37 ℃恒温箱中培养56-64 h[3]，收获细胞前3 h加入浓度为10 μg/ml 的秋水仙素5滴，使终浓度达0.08-0.1 μg/ml。

1.3 标本制备

标本按照参考文献的方法进行制备[4]。

1.3.1 收集细胞 实验人员将培养细胞全部转入15 ml塑料离心管中，以1 000 rpm 离心8-10 min， 弃上清液,向刻度离心管中加入预温37 ℃的低渗液 7 ml，用一次性塑料滴管混匀，置37 ℃恒温水浴中低渗 30-35 min。

1.3.2 固定 低渗后，实验人员加入1 ml 固定液(甲醇∶冰乙酸=2∶1)预固定，1 000 rpm离心8-10 min，弃上清液，加入7 ml 固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)混匀进行第一次固定，固定时间20 min，1 000 rpm离心8-10 min，弃上清液。第二次和第三次固定同第一次固定。

1.3.3 制片 弃上清液后，实验人员视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液；吸取细胞悬液滴在冰冻载玻片上滴2-3滴，酒精灯上过火焰，晾干，用1∶10 Giemsa 染色液染色10 min(pH=6.8磷酸缓冲液稀释)，自来水洗去多余染液，吹干，中性树胶封片后镜检。

2 结果

2.1 染色体结构畸变的观察

人离体外周血淋巴细胞经培养制片后，镜下观察染色体分布均匀、形态良好、染色体畸变易于辨认的分裂相，观察结果见表1。经过4个辐照剂量的观察，3.0 Gy电离辐照剂量诱导染色体畸变率较高，其畸变类型多见微小体、染色体碎片、双着丝粒染色体(dic)，少见环状染色体(r),畸变类型见图片，结合细胞生长情况，认为3.0 Gy剂量为理想的诱导染色体畸变辐照剂量。染色体畸变类型见图1-3。

表1 不同剂量X射线辐照后染色体畸变率

图1 双着丝粒染色体+环状染色体+染色体断片

图2 微小体+染色体断片

图3 染色体断片

2.2 实验教学效果

教师将制作的畸变玻片标本用于2019级临床医学专业医学遗传学实验教学中。经178名学生问卷星调查，学生对染色体结构畸变实验教学效果优评率为90.45%，认为染色体畸变标本分裂相多且分散良好的占82.02%，对畸变类型差评者仅占2.81%。

3 讨论

染色体畸变是指染色体数目或者结构发生的改变，按发生原因可以分为自发畸变、诱发畸变和亲代遗传，造成染色体畸变的原因有物理因素、化学因素、生物因素和母亲年龄等因素。染色体畸变与人类遗传病密切相关[5]。本文主要探讨染色体结构畸变标本制备。电离辐射属于物理因素，普遍认为电离辐射引起的染色体畸变为染色体型结构畸变，主要表现为微小体、断片、双着丝粒、环状染色体等，化学致突变剂和病毒感染引起染色单体型畸变较常见[6]。

染色体畸变是致突变的重要因素，教学方式是通过显微镜下观察染色体畸变玻片标本来验证染色体畸变的理论知识，但存在的问题是染色体数目畸变玻片标本数量充足，结构畸变玻片标本无法满足每位学生镜下观察的需求，这给实验教学带来了一定的困难。作者用X射线诱导染色体结构畸变，以获得分裂相多且染色体畸变类型丰富的玻片标本。由于X电离辐射剂量对标本质量有较大的影响，作者设定了4个X电离辐射剂量组，通过实验结果发现辐射剂量低于2.0 Gy时，染色体畸变率较低；照射剂量达4.0 Gy时，细胞生长缓慢，染色体分裂相大量减少，染色体畸变率虽高，但显微镜下观察难度增加，所制备的标本已不能满足教学需要；而3.0 Gy放射剂量较易发现多种染色体畸变类型，主要包括微小体、断片、双着丝粒、环状染色体等畸变类型，且染色体分裂相也易于寻找，显微镜下观察效果良好，可以制作出实验教学所需玻片标本，提示3.0 GyX射线辐照剂量是制作染色体畸变标本较合适的放射剂量，且满足学生独立观察染色体结构畸变的需求，改变示教及模式图的教学方式；经学生问卷星调查分析，染色体畸变观察实验教学效果优评率达90.45%，满足了染色体畸变观察实验教学的需求。

实验教学工作的重点在于激发学生探求科学研究的兴趣，使实验室成为培养学生创新精神和实验能力的主要阵地[7]。这需要克服各种困难，大胆探讨，提高技术水平，才能开创具有特色的、多样化的实验教学课程。染色体畸变玻片标本制作的难点在于辐照剂量，掌握合适的辐照剂量是成功制作标本的关键。本中心制作的100张染色体结构畸变玻片标本已用于医学遗传学实验教学，使学生对染色体畸变有了感性认知，提高了医学遗传学实验教学的效果，并为染色体畸变玻片标本的制作提供技术参考。