响应面法优化地参发酵酒的工艺条件

黄小兰，何旭峰，周祥德，周 浓，郭冬琴，杨 勤

（1.重庆市万州食品药品检验所，重庆 404100；2.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404100；3.重庆三峡医药高等专科学校中医学院，重庆 404120）

地参（Lycopus lucidus）为唇形科地笋属植物毛叶地笋（Lycopus lucidusvar.hirtusRegel.）的干燥根茎，又名虫草参、地笋等[1]。地参营养丰富，蛋白质含量约5%，包含17种氨基酸成分[2]；总糖含量高达46%，包括可溶性多糖和还原糖[3]；除此之外，还富含多种矿物元素和维生素[4-5]，其饱满脆嫩的根茎可作为蔬菜食用，享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美誉[6]。现代研究证明，地参中含有多种活性成分，酚酸类物质总量约7.4 mg/g[7]，白桦脂酸、熊果酸和齐墩果酸类三萜酸物质含量约2.4 mg/g[8]，多糖含量约16%[3，9-10]，具有抗氧化、降血糖血脂、增强免疫力和抗肿瘤等作用[11-13]，保健价值突出。

地笋的地上部分为中药材泽兰，是其主要入药部位[14]，地下部分地参一直被认为是非药用部位而未被重视，造成资源浪费。地参除了直接当蔬菜食用外，初级加工品有干地参[15]和油酥地参[16]，产业延伸不长、附加值低。近年来，有学者利用微生物发酵技术，向牛奶中加入少量地参汁进行发酵制得地参复配凝固型酸奶[17]，采用地参酸辣发酵液制备地参酸辣发酵羊蹄[18]，但该类产品中地参均作为辅料参与，利用率低，且消费群体略显狭窄，受众面有限。因此，如何深度开发地参，提高利用率，产生经济价值显得尤为必要。目前，以药食同源类植物[19]、水果[20]等生产的发酵酒因其酒度低、营养丰富、清爽适口、风味典型等诸多优势，深受大众喜爱，发展迅猛，而目前国内外尚鲜见地参发酵酒的研究报道。

本研究以地参和糯米为原料制备地参发酵酒，采用单因素试验和响应面法优化其发酵工艺，并进行品质分析。不仅能充分利用地参资源，提高其综合利用价值，顺应当前人们对养生保健的追求，还能带动地参种植业的发展，促进农业经济发展，助力乡村振兴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜地参：采挖自重庆市万州区恒合乡石桶寨村；糯米：重庆巴子国农业有限公司；酿酒曲（含酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根霉（Rhizopus）、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和植酸酶）：安琪酵母股份有限公司；丹参素（纯度＞98.8%）：上海安谱璀世标准技术服务有限公司；咖啡酸（纯度＞99.8%）：坛墨质检标准物质中心；迷迭香酸（纯度＞90.5%）：中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器与设备

RetschGM200型刀式研磨仪：德国莱驰公司；WXT-A40型多功能电蒸笼：潮州市潮安区东凤镇沃喜同电器厂；30×30 cm温控发酵桶：酿哥酿酒设备有限公司；精密酒精计（量程：0～100%，分度值：0.1%）：河间市振岩仪器仪表厂；LC-20AT型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；PL602E型百分之一天平：瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司；MSE225S-CE-DU型十万分之一电子天平：德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 地参发酵酒加工工艺流程及操作要点

操作要点：

鲜地参、糯米预处理：取鲜地参洗净泥沙，自然晾干水分至50%左右，然后用刀式研磨仪将其打碎成米粒大小。糯米去杂洗净，加入50 ℃左右的温热水在室温下浸泡过夜，使米粒充分吸水膨胀达到用手捻米粒时能呈粉状，米粒浸透无白心。

蒸熟、摊凉：将地参与糯米（干质量）按7∶3比例混合均匀，放入电蒸笼中蒸制45 min至物料无硬心，然后焖20 min左右。取出置于洁净的纱布上，摊凉至30 ℃左右。

拌曲：将摊凉的物料置于发酵桶内，按照一定的料液比添加纯净水，再按物料干质量的0.5%称取酿酒曲并加入其中，搅拌均匀，盖盖水封。

发酵：在26 ℃下发酵一定时间，待产气量显著下降后终止发酵。

过滤：待发酵完全后，取出用5层纱布挤压过滤。

澄清、灭菌：取过滤后的地参发酵酒置于广口瓶中，密封，70 ℃水浴热处理20 min。

陈酿：取热处理后的地参发酵酒于室温下陈酿15 d。

1.3.2 发酵酒发酵工艺优化单因素试验

以得酒率、酒精度、总酸、残糖量、迷迭香酸、感官评分等为评价指标，以鲜地参质量为基准，糯米添加量分别为20%、25%、30%、35%、40%，蒸制45 min，混合料按照料液比1.0∶1.8（g∶mL）加入纯净水，接种0.5%的酿酒曲，在26 ℃条件下发酵8 d，考察不同的糯米添加量对地参发酵酒品质的影响。在此基础上，依次考察料液比（1.0∶0.6、1.0∶1.0、1.0∶1.4、1.0∶1.8、1.0∶2.2（g∶mL））、酿酒曲接种量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、发酵温度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）、发酵时间（4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）对地参发酵酒品质的影响。

1.3.3 地参发酵酒发酵条件优化响应面试验

在单因素试验基础上，固定糯米添加量30%和料液比1.0∶1.8（g∶mL），选择酒曲接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）3个因素为自变量，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为评价指标，设计3因素3水平Box-Benhnken试验设计方案[21-22]，确定地参发酵酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验因素及水平见表1。

表1 地参发酵酒发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization of fermented Lycopus lucidus wine

1.3.4 得酒率计算

1.3.5 分析检测

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法；总酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示剂法；残糖：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法；甲醇：按照GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》；铅：按照GB 5009.12—2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》。丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量测定：参照黄小兰等[7]HPLC法。

1.3.6 感官评价

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官分析方法，选择10位具有一定品酒知识和能力的人员组成感官评价小组，分别对地参发酵酒的外观、香气、口感和典型性4个方面按照表2的评分标准进行打分，满分100分，结果取平均值。

表2 地参发酵酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Lycopus lucidus wine

1.3.7 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件对测定数据进行处理和绘制试验结果图，结果以3次平均值表示，采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 地参发酵酒发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 糯米添加量的确定

不同糯米添加量对地参发酵酒品质的影响见图1。由图1可知，随着糯米添加量在20%～40%范围内的增大，酒精度和残糖含量随之升高，但迷迭香酸呈现大幅下降趋势。这是由于糯米的淀粉含量较高，同时迷迭香酸属于地参的特征成分[7]。从感官评分上看，随着糯米添加量在20%～40%范围的增大，酒色逐渐从深棕色向橘红色转变，香气也从较重的地参药材味向米酒香气变化，感官评分逐渐升高；并在糯米添加量为30%时，感官评分最高，为84.41分；但当糯米添加量为40%时，米酒香气过浓，导致地参风格不明显，感官评分略有下降。从得酒率和总酸指标来看，没有明显的变化规律，当糯米添加量为30%时，得酒率最高，为46.67%，总酸含量为3.45 g/L。因此，选择最适糯米添加量为30%。

图1 糯米添加量对地参发酵酒品质的影响Fig. 1 Effect of glutinous rice addition on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.2 料液比的确定

不同料液比对地参发酵酒品质的影响见图2。由图2可知，随着料液比在1.0∶0.6～1.0∶2.2（g∶mL）范围内的增加，酒精度、总酸、残糖和迷迭香酸随之降低。当料液比为1.0∶0.6～1.0∶1.4（g∶mL）时，地参酒理化品质（酒精度、总酸、迷迭香酸）较高，但酒体颜色较深、光泽度较差，感官评分、得酒率较低，生产成本高；当料液比为1.0∶1.8（g∶mL）时，感官评分最高，为83.47分，酒精度为10.07%vol，得酒率为60.08%，总酸含量3.09 g/L，残糖含量4.10 g/L，迷迭香酸含量为27.28 g/L；而当料液比为1.0∶2.2（g∶mL）时，酒体颜色变得较淡，酒香味不足，味道寡淡，感官评分降低且得酒率也略微下降。因此，选择最适料液比为1.0∶1.8（g∶mL）。

图2 料液比对地参发酵酒品质的影响Fig. 2 Effect of solid-liquid ratio on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.3 酿酒曲接种量的确定

不同酿酒曲添加量对地参发酵酒品质的影响见图3。由图3可知，随着接种量在0.1%～0.9%范围内的增大，迷迭香酸含量变化不明显。残糖含量随着接种量在0.1%～0.9%范围内呈现下降趋势，因为酿酒曲越多，更有利于酵母将糖类物质充分分解转化为酒精，酒精度升高。酒曲接种量为0.5%时，感官评分为82.47分，酒精度为10.36%vol，总酸含量3.01 g/L，残糖含量8.48 g/L，迷迭香酸含量为27.89 g/L。但当酒曲接种量＞0.7%时，酒精度反而略有降低，可能是因为酒曲量过多，发酵初期酵母基数大，繁殖迅速，消耗大量糖分物质，快速积累的代谢物过早抑制了酵母的活性[23]，且此时总酸的增量不明显，同时，大量的酵母菌残留对地参发酵酒的风味和口感产生了不良影响[24]，感官评分下降，仅为76.20分。接种量为0.1%时，残糖量最高为9.86 g/L，酒精度也最低为9.58%vol，底物未被充分利用。因此，选择最适酿酒曲接种量为0.5%。

图3 酿酒曲接种量对地参发酵酒品质的影响Fig. 3 Effect of Jiuqu inoculum on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.4 发酵温度的确定

发酵温度影响根霉、酵母的生长和繁殖，从而影响发酵能力的大小[25]。本试验结合根霉、酿酒酵母的最适生长温度22～30 ℃。不同发酵温度对地参发酵酒品质的影响见图4。由图4可知，当发酵温度为22～26 ℃时，根霉和淀粉酶的活力不足，不能迅速将淀粉类物质分解为单糖，积累足够的糖类物质供酵母发酵，造成酒精度不高。发酵温度为26 ℃时，根霉、酵母菌生长速率适宜，所得地参发酵酒酒精度最高为10.54%vol，感官评分最高为83.00分，同时浸出的迷迭香酸含量随着温度的升高缓慢增加，为27.80 g/L，总酸含量为2.80 g/L，残糖含量7.69 g/L。当发酵温度＞26 ℃之后，根霉、酵母菌的生长繁殖快，新陈代谢旺盛，产酒能力强，但同时较高的温度易引起酒精、挥发性风味物质损失[26]，造成酒精度下降，酸味较重，香气口感较差，感官评分降低。因此，选择最适发酵温度为26 ℃。

图4 发酵温度对地参发酵酒品质的影响Fig. 4 Effect of fermented temperature on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.5 发酵时间的确定

不同发酵时间对地参发酵酒品质的影响见图5。由图5可知，当发酵时间为4～8 d时，随发酵时间的延长，酒精度、总酸、迷迭香酸含量升高，残糖量降低。当发酵时间为8 d时，感官评分最高，为83.12分，酒精度为10.21%vol，总酸含量2.80 g/L，残糖含量6.42 g/L，迷迭香酸含量为27.56 g/L。发酵时间＞8 d后，酒精度出现下降趋势，酒体酸味加重，可能是随着发酵时间的延长，乙醇向乙酸发生了转变，此时口感也略差。因此，选择最适发酵时间为8 d。

图5 发酵时间对地参发酵酒品质的影响Fig. 5 Effect of fermentation time on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.2 地参发酵酒发酵工艺优化响应面试验

2.2.1 地参发酵酒响应面试验结果与分析

在单因素试验基础上，固定糯米添加量30%和料液比1.0∶1.8（g∶mL），选择酒曲接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）3个因素为自变量，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为评价指标，进行3因素3水平Box-Benhnken试验设计，结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 地参发酵酒发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments for fermentation process optimization of fermented Lycopus lucidus wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6软件，对表3结果进行回归拟合分析，建立二次回归方程如下：Y1=10.29+0.051A+0.48B+0.48C+0.11AB-0.033AC-0.18BC+0.040A2-0.45B2-0.12C2；Y2=87.31+0.68A+3.00B+3.37C+0.66AB-0.86AC-1.15BC-3.09A2-4.38B2-2.38C2。

由表4可知，酒精度模型中F值=20.92，P值=0.000 3（P＜0.01），表明地参发酵酒酒精度与3因素之间回归效果极显著，失拟项P值=0.139 9（P＞0.05），即失拟项相对于纯误差不显著，表明该模型能够较显著拟合地参发酵酒酒曲接种量、发酵温度和时间对酒精度的影响。模型的决定系数R2=0.964 1，校正决定系数R2Adj=0.918 0，变异系数（coefficient of variation，CV）=1.60%，说明该模型96.41%的数据的可变性可用此模型解释，只有1.60%的变异不能由该模型解释。感官评分模型中F值=26.27，P值=0.000 1（P＜0.01），表现为极显著，失拟项P值=0.981 2（P＞0.05），模型的决定系数R2=0.971 2，校正决定系数R2Adj=0.934 3，变异系数CV=1.44%。由此表明所建的酒精度和感官评分模型拟合成功。

由P值可知，在各因素中，一次项B、C和二次项B2对酒精度和感官评分均表现为极显著的影响（P＜0.01），交互项BC对酒精度表现为显著影响（P＜0.05），二次项A2、C2对感官评分影响极显著（P＜0.01），其余均表现为不显著（P＞0.05）。根据F值可知，影响地参发酵酒酒精度的因素顺序为：发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞酿酒曲接种量（A）；影响感官评分的因素顺序为：发酵时间（C）＞发酵温度（B）＞酿酒曲接种量（A）。

2.2.2 响应面分析

利用Design-Expert 8.0.6得到二次回归方程的响应面，其曲面图代表两个试验的交互作用，坡度大小判断因素对响应值的影响程度，各因素交互作用对感官评分和酒精度影响的响应面及等高线见图6。

图6 各因素间交互作用对感官评分和酒精度影响的响应面及等高线Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score and alcohol content

由图6可知，发酵温度对酒精度和感官评分的影响强于接种量。当发酵温度不变时，随着接种量的提高，酒精度缓慢升高，当接种量达到0.7%时，酒精度达到最高，感官评分呈现先上升后降低的趋势，在接种量为0.5%时，评分最高；当接种量不变时，随着发酵温度的上升，酒精度和感官评分均呈现先上升后下降的趋势，当发酵温度为27 ℃时，酒精度达到最高，当发酵温度为26 ℃时，感官评分达到最高。由图6可知，发酵时间对酒精度和感官评分的影响强于接种量。当接种量不变时，随着发酵时间的增长，酒精度和感官评分均呈上升趋势，当发酵时间达到10 d时，酒精度到达最高，当发酵时间达到9 d时，感官评分到达最高；当发酵时间不变时，随着接种量的上升，酒精度呈缓慢上升趋势，当接种量为0.7%时，酒精度达到最高，感官评分呈现先上升后下降的趋势，当接种量为0.5%时，感官评分到达最高。

由图6亦可知，发酵温度对酒精度和感官评分的影响强于发酵时间。当发酵时间不变时，随着发酵温度的升高，酒精度和感官评分呈先上升后下降的趋势，当发酵温度达到27 ℃时，酒精度到达最高，当发酵温度达到26 ℃时，感官评分到达最高；当发酵温度不变时，随着发酵时间的增长，酒精度呈上升趋势，当发酵时间达到10 d时，酒精度达到最高，感官评分呈先上升后下降的趋势，当发酵时间达到9 d时，感官评分达到最高。

总的来看，发酵温度对酒精度和感官评分的影响最强，其次为发酵时间，最后为接种量。

2.3 验证试验

通过Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，得到其最佳发酵工艺为酿酒曲接种量0.46%，发酵温度26.89 ℃，发酵时间8.78 d。在此优化条件下，酒精度预测值为10.42%vol，感官评分预测值为87.37分。为检验模型的准确性，结合生产实际，修正最佳发酵工艺为酿酒曲接种量0.50%，发酵温度27 ℃，发酵时间9 d。在此优化条件下进行3次平行验证试验，得到酒精度实际值为10.37%vol，感官评分实际值为87.69分，与预测值接近。因此，响应面法对地参发酵酒发酵条件的优化是可行的。

2.4 地参发酵酒理化指标分析

取地参发酵酒进行理化指标测定，结果表明，总糖含量（以葡萄糖计）为13.12 g/L；总酸含量（以乙酸计）为3.24 g/L；丹参素含量为26.06 mg/L，迷迭香酸含量为32.18 mg/L，咖啡酸含量为36.84 mg/L。甲醇和铅均未检出。

3 结论

本研究利用地参和糯米为原料进行地参酒发酵。在单因素试验的基础上，利用响应面法优化得到地参发酵酒的最优发酵工艺为酿酒曲接种量0.50%，发酵温度27 ℃，发酵时间9 d时。在此条件下，地参发酵酒酒色呈橘红色，透明度好，有地参特有的香气和米酒的清香，无异味，口感清甜纯正，和谐爽口，富含酚酸类功能性成分，保健价值突出，开发前景广阔。