响应面法优化常温植物基核桃酸奶的发酵工艺

刘俐彤，王 超，陶 亮，3，4，盛 军，3，4，赵存朝，田 洋，3，4

（1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201；3.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南省药食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201）

核桃又称胡桃（Juglans regia），胡桃科胡桃属植物，世界四大坚果之一，其种植面积和产量均呈快速增长趋势，有良好的市场开发前景。核桃富含多种对人体有益的营养物质：蛋白质、维生素、多酚、不饱和脂肪酸[1-4]等，具有降血脂[5]、抗疲劳[6]、抗癌[7]等功效。其中，核桃仁含有61%～74%的油脂、15%～19%的蛋白质、8%～13%的碳水化合物[8]，具有较高的开发利用价值及营养价值。常温酸奶，又称“灭菌型酸奶”，与其他酸奶的制作工艺相比多一次杀菌[9]，这使其可在4～25 ℃条件下保存4～6个月左右，大大延长了货架期，减少运输成本，拓宽了消费者的酸奶选择范围。2020年，中国卫生监督协会发布团体标准T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》，并给出了关于植物酸奶的定义，即植物酸奶是以含有一定蛋白质的植物和（或）其制品为原料，经杀菌、发酵后pH 值降低，发酵前或发酵后添加或不添加非动物来源配料，加工制成的植物蛋白饮料产品[10]。植物基酸奶将酸奶中的“动物原料”换成“植物原料”，利用植物原料低脂肪[11]、低热量、可降低胆固醇[12]等特点，有效避免乳糖不耐症[13]人群，减少了动物饲养成本[14]，提高了酸奶的营养价值以及功能特性。目前，市场上的植物基酸奶种类单一且存在很多问题：大豆植物基酸奶，较难解决大豆自带的豆腥味以及过敏反应[15]；燕麦植物基酸奶中燕麦谷物类自带的粘度以及不溶解性，使其口感及质构不佳[16]；纯椰浆植物基酸奶蛋白质含量较低，色泽偏暗，导致其口感及风味欠佳[17]。

综合考虑核桃仁的健康益处和消费者需求，本研究以核桃仁为主要原料制备核桃仁酸奶，利用单因素试验考察菌种添加量、核桃浆料液比、稳定剂添加量、发酵时间、发酵温度因素对常温植物基核桃酸奶感官评分的影响，并在此基础上通过响应面优化其发酵工艺。旨在开发一款方便、营养、美味的常温植物基核桃酸奶，为国内常温植物基核桃酸奶的开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃仁：大理漾濞核桃有限责任公司；白砂糖：市售；稳定剂（代号HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370、HBTA8750）：江苏豪蓓特食品化学有限公司；直投式菌种[乳酸菌Mild 1.0、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）kT-A8、乳酸菌R704（包含乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactissubsp.cremoris））]：科汉森菌种生物科技公司；奶酪香精：河南万邦实业有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JMS60胶体磨：常州华奥仪器制造有限公司；150磨浆机：广西南宁旭昆机电设备有限公司；HJJ-6水浴恒温电动搅拌器：常州华奥仪器制造有限公司；RW-20搅拌器：日本IKA公司；SVJ-358智能商用型酸奶机：北京世纪阳光有限公司；VL-7F落地式低速冷冻离心机：长沙市百诺克离心机仪器有限公司；SRH高压均质机：上海申鹿均质机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常温植物基核桃酸奶的加工工艺流程及操作要点

去皮核桃仁→粗磨→细磨→过滤去渣→预热→混料→均质→灭菌→发酵→破乳→调香→杀菌→无菌灌装→常温植物基核桃酸奶成品

操作要点：新鲜的去皮核桃仁用水清洗5次以上并浸泡一夜，将核桃仁加适量纯净水匀速倒入磨浆机，得均一浆液，倒入胶体磨，经过滤除渣得到细腻顺滑的核桃浆。向核桃浆内加入适量的稳定剂和8%白砂糖，温度控制在45～60 ℃，在压力为20 MPa下均质5 min，均质后将核桃浆放入高压灭菌锅中，在90 ℃的条件下灭菌15 min，然后冷却至42 ℃。在无菌操作的条件下，将其放入酸奶机中，接种一定量的发酵剂，发酵温度为42 ℃，发酵时间7 h。发酵完成后的核桃酸乳于搅拌器中1 000 r/min搅拌3 min，添加0.01%奶酪香精进行调香，充分混匀并封口。在75 ℃条件下杀菌25 s后冷却至12 ℃，即得常温植物基核桃酸奶成品。

1.3.2 常温植物基核桃酸奶发酵工艺优化单因素试验

以感官评分及酸度为指标，发酵温度为42 ℃，发酵时间为7 h，发酵剂菌种总添加量为0.4%时，对直投式乳酸菌种Mild1.0、kT-A8、R704、Mild1.0 ∶kT-A8=1 ∶1、Mild1.0 ∶R704=1∶1、kT-A8∶R704=1∶1进行筛选及菌种复配比例的确定。

在此基础上，以酸度及感官评分为评价指标，依次考察发酵剂添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、核桃仁与水料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（kg∶L））；稳定剂种类（HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370、HBT-A8750）及添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵时间（5 h、7 h、9 h、11 h、13 h）、发酵温度（36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃）对常温植物基核桃酸奶产品品质的影响。

1.3.3 常温植物基核桃酸奶发酵工艺优化响应面试验

以感官评分（Y）为响应值，考察发酵时间（X1）、发酵剂添加量（X2）、核桃仁与水料液比（X3）3个因素对结果的影响，利用Box-Behnken[18]试验设计3因素3水平试验，优化常温植物基核桃酸奶发酵工艺。响应面试验因素与水平见表1。

表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization

1.3.4 感官评价

常温植物基核桃酸奶的感官评价参考国标GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的规定进行。由20名有一定品评经验的专业人员组成评定小组，分别从色泽（20分）、组织状态（20分）、气味（30分）、滋味（30分）4项指标对常温植物基核桃酸奶采用百分制打分，具体感官评分标准见表2。

表2 常温植物基核桃酸奶的感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standards of plant-based walnut yogurt at room temperature

1.3.5 分析检测

酸度：根据GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中的酚酞指示剂法[19]；蛋白质含量：根据GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法[20]；脂肪含量：根据GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的盖勃氏法进行测定[21]；凝乳时间：酸奶瓶倾斜30 °，以酸奶无流动时刻作为酸奶凝乳时间；霉菌和酵母：参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[22]；乳酸菌：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[23]；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》[24]；致病菌：参照GB 29921.3—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》[25]。

1.3.6 数据处理

采用Excel 2013、SPSS 19.0统计软件对试验数据进行分析，利用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析，每个试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 常温植物基核桃酸奶发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 不同发酵菌种种类及添加量对常温植物基核桃酸奶的影响

不同乳酸菌种类（添加量均为0.4%）对常温植物基核桃酸奶感官评分、酸度、活菌数及凝乳时间的影响结果见表3。

表3 发酵菌种筛选试验结果Table 3 Screening tests results of fermentation strains

由表3可知，当发酵菌种为Mild1.0∶R704=1∶1时，其感官评分最高，为（87.84±0.43）分，使核桃风味完全释放，又保留了酸奶独特风味。采用单一发酵菌种发酵凝乳时间过长，酸度较低，活菌数量较少，甚至产生刺激性气味。采用乳酸菌kT-A8作为发酵剂，酸度仅达28°T，活菌数量仅为0.7×107CFU/mL。采用复配菌种进行发酵，可增加活菌数量、提高酸度。采用Mild1.0∶R704=1∶1作为发酵剂后，酸度和活菌数量有了明显提高，分别为43°T、4.5×109CFU/mL。不同的菌种发酵后会产生不同的挥发性风味物质，挥发性风味物质含量的多少及其相互作用都会影响最终产品的风味[26]，复配菌种所产生的协同作用香味物质使得常温植物基核桃酸奶风味醇厚。因此，最佳发酵菌种为Mild1.0∶R704=1∶1。

以乳酸菌Mild1.0∶R704=1∶1混合为发酵剂，不同发酵剂添加量对常温植物基酸奶的感官评分及酸度的影响见表4。由表4可知，当发酵剂添加量为0.2%～0.6%时，活菌数量在发酵剂添加量0.4%时最高，为5.9×109CFU/mL；酸度在发酵剂添加量为0.5%时出现最低值39°T，凝乳时间在发酵剂添加量为0.3%时出现最高值12 h；当发酵剂添加量为0.6%时，其感官评分最高，为（89.20±0.56）分，酸度、凝乳时间、乳酸菌数分别为53°T、4.5 h、6.7×107CFU/mL；当发酵剂添加量为0.6%～0.7%时，酸度无明显变化、凝乳时间增长、乳酸菌数减少及感官评分也随着下降。因此，混合发酵剂最适添加量为0.6%。

表4 发酵剂添加量筛选试验结果Table 4 Screening tests results of starter addition

2.1.2 不同核桃仁与水料液比对常温植物基核桃酸奶的影响

不同核桃仁与水料液比对常温植物基核桃酸奶的影响结果见图1。由图1可知，当料液比为1∶1～1∶3（kg∶L）时，感官评分持续增加，而酸度出现稍许降低后增加的趋势；当料液比达到1∶3（kg∶L）时，感官评分达最大值，为（85±2.40）分，酸度为（47±0.98）°T；当料液比为1∶3～1∶5（kg∶L）时，感官评分和酸度均逐步下降。这是由于料液比过大时，核桃仁的酮类香味[27]不突出，口感偏淡；当料液比过小时，核桃浆浓度过大，导致核桃香气过重，无法均匀呈现香味，口感下降，引发不适。因此，最适料液比为1∶3（kg∶L）。

图1 料液比对常温植物基核桃酸奶品质的影响Fig. 1 Effect of material-liquid ratio on quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.3 不同稳定剂种类及添加量对常温植物基核桃酸奶的影响

不同稳定剂种类（添加量均为5%）对常温植物基核桃酸奶品质的影响见表5。由表5可知，当采用稳定剂HBT-A3168时，感官评分达最大值，为（89.92±0.57）分，且凝乳时间较短，为5.0 h，有利于提高生产效率，酸度达46 °T，能均匀地呈现常温植物基核桃酸奶的风味。因此，最适稳定剂为HBT-A3168。

表5 稳定剂种类筛选试验结果Table 5 Test screening tests results of stabilizer types

稳定剂HBT-A3168添加量对常温植物基核桃酸奶品质的影响见图2。由图2可知，当稳定剂HBT-A3168添加量在2%～8%时，感官评分、酸度随之增加；当稳定剂HBTA3168添加量为6%时，感官评分达最大值，为（86±0.98）分，酸度为42°T；当稳定剂HBT-A3168添加量＞6%之后，感官评分下降、酸度下降后缓慢回升。这是因为适量添加的稳定剂降低了常温植物基酸奶乳清的析出率，稳定了植物基蛋白。因此，最适稳定剂HBT-A3168的添加量为6%。

图2 稳定剂HBT-A3168添加量对常温植物基核桃酸奶品质的影响Fig. 2 Effect of stabilizer HBT-A3168 addition on the quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.4 不同发酵时间对常温植物基核桃酸奶的影响

不同发酵时间对常温植物基核桃酸奶品质的影响结果见图3。由图3可知，当发酵时间为5～7 h时，感官评分及酸度随发酵时间增加而增加；当发酵时间为7 h时，感官评分达最高，为（87.86±0.68）分，酸度为39°T；当发酵时间＞7 h 时，感官评分持续下降、酸度持续上升。发酵时间过短导致其发酵不完全，酸奶风味及口感未完全体现；发酵时间过长，乳清析出过多，酸奶过酸影响口感。其次，由于乳酸菌的减少，酸奶容易受杂菌污染而影响酸奶的品质[28]。因此，最适发酵时间为7 h。

图3 发酵时间对常温植物基核桃酸奶品质的影响Fig. 3 Effect of fermentation time on the quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.5 不同发酵温度对常温植物基核桃酸奶的影响

不同发酵温度对常温植物基核桃酸奶品质的影响结果见图4。由图4可知，当发酵温度为36～42 ℃时，感官评分及酸度均随之增高；当发酵温度为42 ℃时，感官评分达到最高，为（82±1.2）分，酸度为42°T；当发酵温度＞42 ℃之后，感官评分出现下降、酸度呈上升趋势。发酵温度过低，导致有益菌不够活跃，导致酸奶口感较差；发酵温度过高，抑制其益生菌生长，影响酸奶发酵。适宜的发酵温度可缩短凝乳时间，提高生产效率，赋予常温植物基核桃酸奶细腻饱满的口感。因此，最适发酵温度为42 ℃。

图4 发酵温度对常温植物基核桃酸奶品质的影响Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of plantbased walnut yogurt at room normal temperature

2.2 常温植物基核桃酸奶发酵工艺优化响应面试验

2.2.1 响应面试验结果与分析

基于Box-Behnken 设计，在单因素试验结果的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件进行分析，选取发酵时间（X1）、发酵剂添加量（X2）、料液比（X3）3个因素，以感官评分（Y）为响应值，采用响应面试验对常温植物基核桃酸奶加工工艺进行优化，试验设计及结果见表6，方差分析见表7。

将所得试验数据利用Design Expert 8.0.6软件对表6数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=88.84+1.33X1+2.91X2+1.51X3-0.8X1X2-0.87X1X3-2.44X2X3-7.20X12-5.95X22-3.44X32

表6 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments for optimization of fermentation technology

由表7可知，该回归模型的P值＜0.000 1，说明回归模型的影响达到极显著水平（P＜0.01）；回归模型失拟项P=0.227 5＞0.05，表明二次回归模型与实际试验拟合性充分，模型失拟不显著，表明此模型可用于试验拟合。模型的决定系数R2=0.985 1，表明该模型能解析98.51%的响应值变化，存在1.49%的总变异，说明该模型拟合程度相对较好，试验误差较小。校正决定系数R2adj=0.965 9，说明该模型响应值的变化有96.59%来源于所选变量。响应值Y的变异系数（coefficient ofvariation，CV）与试验精确度和重复性成反比，其CV=1.39%＜5%，说明试验的精确度和重复性较高，且可信度较高。由P值可知，一次项X2和X3、二次项X12和X22对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项X1、交互项X2X3、二次项X32对结果影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对感官评分的影响顺序为：X2（发酵剂添加量）＞X3（料液比）＞X1（发酵时间）。

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.2.2 各因素间交互作用的影响

如图5所示，交互项X2X3的曲面倾斜度较大，坡度较陡，且等高线呈椭圆形，较密集，说明其交互作用影响显著（P＜0.05），反之，X1X2、X1X3交互作用影响不显著（P＞0.05），各因素间交互作用对常温植物基核桃酸奶的感官评分的影响大小依次为X2X3＞X1X3＞X1X2，与方差分析结果一致。

图5 各因素间交互作用对常温植物基核桃酸奶感官评分影响的响应面及等高线Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of plant-based walnut yogurt at normal temperature

2.2.3 常温植物基核桃酸奶最佳条件的确定和验证试验

通过Design Expert 8.0.6分析得到常温植物基核桃酸奶的最佳发酵工艺条件为：发酵剂添加量6.14%，料液比1.00∶3.21（kg∶L），发酵时间7.28 h，在此优化条件下，常温植物基核桃酸奶感官评分理论值为（89.23±0.45）分。为了验证模型的精准性，考虑到实际操作的可行性，将发酵工艺参数调整为发酵剂添加量0.6%，料液比1∶3（kg∶L），发酵时间7 h，在上述最佳条件下进行3次平行验证试验，得到常温植物基核桃酸奶感官评分实际值为（90.00±0.32）分，与理论值接近，具有一定的实际应用价值。

2.3 常温植物基核桃酸奶理化及微生物指标分析

由表9可知，常温植物基核桃酸奶的蛋白质含量为5.05 g/100 g，脂肪含量为3.00 g/100 g，酸度为52°T，酵母菌和霉菌为10 CFU/g，大肠杆菌和致病菌未检出，相关理化及卫生指标符合中国卫生监督协会发布团体标准T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》标准。

表9 常温植物基核桃酸奶的理化指标和微生物指标Table 9 Physicochemical and microbiological indexes of plant-based walnut yogurt at room temperature

3 结论

本研究通过单因素试验及响应面试验优化常温植物基核桃酸奶发酵工艺条件为混合发酵剂添加量0.6%，核桃浆料液比1∶3（kg∶L），稳定剂HBT-A3168添加量6%，发酵时间7 h，发酵温度42 ℃。此优化条件下，其感官评分为（90±0.32）分，稳定性良好，蛋白质含量（5.05 g/100 g）较高，相关理化及卫生指标符合相关标准要求，是一款健康、方便、新颖的酸奶，符合当下的消费趋势，具有较好的市场前景。