青蒿琥酯通过PI3K/GSK-3β通路对1型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的改善作用研究*

许艳玲 ，赵玉珠 ，付裕 ，穆中一

（1.沈阳市第五人民医院内分泌一科，沈阳 110000；2.辽宁省肿瘤医院泌尿外科，沈阳 110000）

糖尿病是胰岛素相对或绝对不足而导致的新陈代谢慢性紊乱综合征[1]，1型糖尿病是由于胰岛β细胞破坏导致的自身免疫缺陷[2]。研究表明，肥胖和胰岛素抵抗是1型糖尿病的显著特征，其患者的所有慢性并发症与胰岛素抵抗密切相关[3]。目前，治疗1型糖尿病的主要药物为免疫抑制剂如环孢素，但长期使用会机体造成不良反应[4]。因此，寻找对1型糖尿病有效且不良反应少的药物成为研究热点。

青蒿琥酯是青蒿素的半合成水溶性衍生物之一，具有抗炎抗菌、调节免疫、抗肿瘤等药理作用[5]。研究表明，青蒿琥酯可抑制1型糖尿病大鼠的心血管并发症[6]、视网膜病变[7]等。但青蒿琥酯对1型糖尿病的胰岛素抵抗的研究较少。因此，本研究通过建立1型糖尿病动物模型，观察青蒿琥酯对1型糖尿病的胰岛素抵抗作用以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）/糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）/肝糖原合成酶（GS）信号通路的变化，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级的雄性Balb/c小鼠60只[南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2016-0041]，12周龄，体质量（20±5）g。所有小鼠均饲养于恒温（25±2）℃，湿度50%～60%的无特殊病原体环境中，高压灭菌的水和饲料随意进食。本实验方案通过本校实验动物中心的批准，并且在国家卫生研究所关于保护和使用实验动物的方针指导下进行。

1.2 试剂及试剂盒 青蒿琥酯（60 mg，桂林南药股份有限公司生产，批号：LA150444）；链脲佐菌素（STZ）（美国 Sigma，CA-OOS-105），胰岛素（3 mL，赛诺菲制药有限公司，批号：113439）；尿蛋白试剂盒（Merck，批号：232-917-9）；福尔马林（济南百博生物技术股份有限公司）；戊巴比妥钠（上海信裕生物科技有限公司）；葡萄糖测定试剂盒（Merck，批号：MAK013-1KT）；胰岛素酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：PI608）；硫代巴比妥酸试剂盒（齐一生物科技有限公司，批号：QY-R2814）；游离脂肪酸测定试剂盒（Merck，批号：MAK044-1KT）；Trizol试剂、RIPA 缓冲液、PMSF、BSA和BCA试剂（上海碧云天生物技术有限公司，批号：R0016，P0013B，ST505，P0007，P0012S）；PrimeScriptTM RT试剂盒（Takara Biotechnology，批号：RR037B）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康润诚业生物科技有限公司，批号：4309155）；兔抗鼠磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、糖原合成酶激酶-3（GSK3β）、谷氨酰胺合成酶（GS）和GAPDH单分子抗体（Abcam，批号：ab278545，ab38449，ab8805，ab32391，ab81230，ab9485）；兔抗鼠 p-PI3K 和 p-GSK3β（CST，批号：17366，9322）山羊抗兔二抗（CST，批号：7074）；UltraSignal超敏 ECL化学发光底物（4A Biotech，批号：4AW011-100）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组和建模 适应饲养1周后，将小鼠随机分为4组：健康对照组、模型组、青蒿琥酯组和胰岛素组，每组15只。除健康对照组外，其余各组小鼠单次空腹腹腔注射STZ 60 mg/kg[8]。48 h后尾静脉采血测血糖，血糖含量≥10.0 nmol/L，认定为糖尿病模型构建成功。健康对照组空腹注射等量的生理盐水。青蒿琥酯干预浓度选取100 mg/kg，每次灌胃前将青蒿琥酯与生理盐水涡旋成青蒿琥酯混悬液[9]。血糖检测完毕后，青蒿琥酯组按100 mg/kg青蒿琥酯混悬液灌胃，每日1次。健康对照组和模型组每日灌胃等量生理盐水，连续4周。胰岛素组皮下注射4 U/kg甘精胰岛素注射液[10]，每日1次，连续5 d。造模、干预期间死亡大鼠随后补齐。

1.3.2 空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、肝脏三酰甘油（TG）、丙二醛（MDA）、血清游离脂肪酸（FFA）的检测 药物干预结束12 h，所有小鼠给予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射，待麻醉后，将小鼠仰卧于解剖板上固定，分离腹主动脉，采取3 mL全血，3 000 r/min离心10 min分离血清，离心半径为10 cm，于-20℃冰箱保存。葡萄糖测定试剂盒检测血清中FBG含量，胰岛素ELISA试剂盒检测血清中FINS含量。HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。TG由日立7020全自动生化分析仪检测。MDA由硫代巴比妥酸试剂盒检测。FFA由游离脂肪酸测定试剂盒（酶法）检测。

1.3.3 苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠胰腺组织病理学 所有小鼠取血后，安乐死小鼠，摘取完整胰腺组织，取部分组织置入4%多聚甲醛中固定24 h，脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色，镜下观察小鼠胰岛病理学。

1.3.4 Westernblot检测 迅速剥离出肝组织，放入冰PBS洗去血水后。称取所有组小鼠肝组织0.5 mg，放入低温匀浆机100 Hz匀浆10 min后，RIPA缓冲液和苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制蛋白降解液（100∶1）将样本裂解后提取各组总蛋白。通过BCA试剂检测蛋白质的总浓度，将各组的总蛋白浓度调为一致后，将其于100℃进行变性后保存至-20℃。聚丙烯酰酶凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白后，将其转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后用5%脱脂牛奶封闭2h，TBST洗涤3次，每次10min后，将其放入对应的一抗（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、GS和 GAPDH）和一抗稀释混悬液（1∶1 000）中，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，放入二抗和二抗稀释液（1∶4 000）混悬液中，室温孵育2 h。TBST洗涤3次，每次10 min，将超敏发光液ECL滴在膜上，放入化学发光成像仪（USA）进行蛋白显影。通过Image J软件进行分析，相对蛋白表达以GAPDH标准化。

1.3.5 统计学方法 应用SPSS 20.0软件进行数据分析，资料以均数±标准差（±s）表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青蒿琥酯对糖尿病小鼠空腹血糖的影响 STZ注射前，各组小鼠FBG值均差异无显著性。STZ注射后7 d，与健康对照组比较，模型组、青蒿琥酯组和胰岛素组的FBG值显著增加（P＜0.05）。药物干预4周后，与健康对照组比较，模型组的FBG含量显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿琥酯组和胰岛素组的FBG含量显著降低（P＜0.05）。与青蒿琥酯组比较，胰岛素组的FBG含量显著降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠FBG值（±s）Tab.1 FBG values of mice in each group（±s）mmol/L

表1 各组小鼠FBG值（±s）Tab.1 FBG values of mice in each group（±s）mmol/L

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 STZ注射前 STZ注射后 给药4周后健康对照组 10 5.23±0.18 5.33±0.26 5.88±0.59模型组 10 5.46±0.36 18.48±0.39* 29.18±0.39*青蒿琥酯组 10 5.31±0.21 19.72±0.81* 18.38±0.72*#胰岛素组 10 5.36±0.25 18.96±0.75* 11.31±0.35*#

2.2 青蒿琥酯对糖尿病小鼠空腹胰岛素的影响 与健康对照组比较，模型组的FINS和HOMA-IR显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿琥酯组和胰岛素组FINS和HOMA-IR显著降低（P＜0.05）与青蒿酯组比较，胰岛素组的FINS和HOMA-IR显著降低（P<0.05）。见表 2。

表2 各组小鼠FINS和HOMA-IR值（±s）Tab.2 FINS and HOMA-IR values of mice in each group（±s）mU/L

表2 各组小鼠FINS和HOMA-IR值（±s）Tab.2 FINS and HOMA-IR values of mice in each group（±s）mU/L

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 FINS HOMA-IR健康对照组 10 22.81±2.83 7.13±0.66模型组 10 55.61±3.16* 62.38±2.93*青蒿琥酯组 10 28.82±2.11*# 32.41±1.93*#胰岛素组 10 25.91±2.97*# 20.18±2.17*#

2.3 青蒿琥酯对糖尿病小鼠胰岛病理学的影响 健康对照组小鼠胰岛形态规则，呈圆形细胞团，边界清晰，胰岛数和胰岛内细胞数量多且致密，细胞胞体饱满、大小一致，核染清晰；模型组小鼠胰岛明显萎缩，轮廓变形、扭曲，边界模糊，胰岛数与胰岛内细胞数量减少，排列紊乱，分布稀疏，细胞核固缩、分裂甚至缺失，胰岛周围可见炎症细胞浸润；与模型组比较，青蒿琥酯组和胰岛素组小鼠胰岛形态、细胞体以及胰岛数等病理明显减轻，尤其是胰岛素组病理学，更接近健康对照组。见图1。

图1 糖尿病小鼠胰岛病理学（HE染色，×400）Fig.1 Pathology of pancreatic islets in diabetic mice(HE staining，×400)

2.4 青蒿琥酯对糖尿病小鼠TG、MDA和FFA的影响 与健康对照组比较，模型组的TG、MDA和FFA含量显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿琥酯组、胰岛素组TG、MDA和FFA含量显著降低（P＜0.05）。与青蒿琥酯组比较，胰岛素组TG、MDA和FFA含量显著降低（P<0.05）。见表3。

表3 各组小鼠TG、MDA和FFA值（±s）Tab.3 TG，MDA and FFA values of mice in each group（±s）mU/L

表3 各组小鼠TG、MDA和FFA值（±s）Tab.3 TG，MDA and FFA values of mice in each group（±s）mU/L

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 TG MDA FFA健康对照组 10 22.81±2.83 7.13±0.66 41.31±3.85模型组 10 55.61±3.16* 62.38±2.93* 311.83±6.54*青蒿琥酯组 10 28.82±2.11*# 32.41±1.93*#122.62±2.98*#胰岛素组 10 26.69±2.48*# 19.58±2.48*# 80.59±3.67*#

2.5 青蒿琥酯对糖尿病小鼠肝组织中PI3K/GSK3β信号通路的影响 与健康对照组比较，模型组小鼠肝组织中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达量比值显著降低（P＜0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表达量比值显著增加（P＜0.05），GS蛋白表达量显著减低（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿琥酯组和胰岛素组小鼠肝组织中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达量比值显著增加（P＜0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表达量比值显著降低（P＜0.05），GS蛋白表达量显著增加（P＜0.05）。与青蒿琥酯组比较，胰岛素组小鼠肝组织中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达量比值显著增加（P<0.05），p-GSK3β/GSK3β 蛋白表达量比值显著降低（P<0.05），GS蛋白表达量显著增加（P<0.05）。见图 2、表 4。

表4 各组小鼠肝组织PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白与磷酸化水平比值的比较（±s）Tab.4 Comparison of the ratio of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein to phosphorylation level in liver tissues of mice（±s）

表4 各组小鼠肝组织PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白与磷酸化水平比值的比较（±s）Tab.4 Comparison of the ratio of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein to phosphorylation level in liver tissues of mice（±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 p-PI3K/PI3K p-Akt/Aktp-GSK3β/GSK3β GS健康对照组 10 0.98±0.06 1.13±0.09 0.61±0.05 0.74±0.11模型组 10 0.18±0.03* 0.47±0.11* 1.83±0.14* 0.24±0.05*青蒿琥酯组 10 0.47±0.04*# 0.98±0.08*# 1.02±0.08*# 0.49±0.08*#胰岛素组 10 0.74±0.03*# 1.06±0.07*# 0.88±0.06*# 0.61±0.05*#

图2 各组小鼠肝组织PI3K、Akt、GSK3β和GS蛋白表达情况Fig.2 Expression of PI3K，Akt，GSK3β and GS protein in liver tissues of mice in each group

3 讨论

糖尿病是由于致病因素引起的胰岛素分泌缺乏或胰岛素抵抗，从而引发糖代谢紊乱的疾病[11]。其中1型糖尿病是胰腺β细胞被破坏，致使胰岛素分泌不足，导致机体多个器官处于高血糖环境，继而诱发严重的并发症[12]。本实验采用STZ损伤胰岛β细胞，制备1型糖尿病动物模型成功。

目前1型糖尿病主要治疗手段是胰岛素注射，但长期使用会增加感染、低血糖以及视网膜、神经、心血管等疾病的风险[13-14]。因此，寻找有效且不良反应少的药物非常重要。青蒿琥酯是具有过氧桥结构的半倍萜内酯类化合物，主要具有抗疟疾作用，在自身免疫性疾病、过敏性炎症疾病以及感染性疾病中发挥抗炎作用[15]。研究表明，青蒿琥酯可降低糖尿病大鼠中的血糖，从而抑制糖尿病的并发症[16-17]发生。本研究结果显示，青蒿琥酯可降低小鼠血糖浓度，改善小鼠胰岛病理表现，并且对空腹胰岛素抵抗具有抑制作用。青蒿琥酯还可减少1型糖尿病小鼠血清中TG、MDA和FFA含量，说明青蒿琥酯对降低1型糖尿病小鼠的血糖、减轻胰岛素抵抗和改善胰岛病理学具有一定的效果。

肝糖原含量对机体血糖水平的稳定非常重要，PI3K/GSK3β是胰岛素促进葡萄糖合成肝糖原的重要信号通路[18]。PI3K和AKT是GSK3β上游重要因子，PI3K磷酸化后活性增强，进一步激活AKT，然后直接磷酸化GSK3β丝氨酸位点，使其失去活性[19]。GSK3β可抑制GS的活性，导致糖原合成减少[21]。GSK3β与1型糖尿病的病理相关，GSK3β过表达或激活异常均可导致1型糖尿病[21]。本研究结果显示，青蒿琥酯干预1型糖尿病小鼠4周后，小鼠胰腺中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达量比值降低，GSK3β蛋白表达量增加，磷酸化水平减弱，且上述作用仅次于胰岛素，表明青蒿琥酯可能通过激活1型糖尿病胰腺组织PI3K/GSK3β信号通路实现降糖、减轻胰岛素抵抗和改善胰岛病理学的目标。

综上所述，青蒿琥酯具有降低血糖、减轻胰岛素抵抗程度、增加肝糖原含量的作用，其机制与增强PI3K/GSK3β信号通路有关。这为探讨糖尿病胰岛素抵抗的发病机制和防治措施提供新的思路。然而，青蒿琥酯对糖尿病胰岛素抵抗的改善作用，仍需更多动物模型进一步研究。