天津地区猪塞内卡病毒病流行病学调查
2022-08-31孙冬冬周永燚袁雪涛王芳霞哈子明
张 颖 孙冬冬 赵 静 周永燚 袁雪涛 王芳霞 哈子明
（1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402； 2.滨海新区农业农村发展服务中心，天津 300480）
猪塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）引起的一种以鼻镜、蹄部冠状带处出现水泡、溃烂创面等特征的动物传染病，不同年龄阶段的猪均易感。病猪临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水泡性口炎相似而常被忽略，目前该病没有商品化疫苗，制约养猪业的健康发展，造成养猪业的经济损失，因此近几年备受关注。本研究通过对天津地区猪群塞内卡病毒病流行病学调查，为进一步研究提供有力的数据支持。
1 材料与方法
1.1 样品来源
2021年3～9月采自天津市宝坻区、宁河区、西青区等区域3个大型屠宰场和宁河、宝坻2个无害化处理场的样品，其中血清样本共计839份，全血采集后，尽快分离血清，-20℃冷冻保存，备用。组织、口腔棉拭子样本共计404份，将采集的口腔/泄殖腔棉拭子放入含1ml生理盐水的无菌EP管中，组织放入采样袋中，编号后冷藏备用具体信息如下（表1、表2）。
表1 血清样本统计
表2 组织病料样本统计
1.2 主要试剂和耗材
微量加样器thermo；加液槽；去离子水；电热恒温培养箱DNP-9052AE；全自动洗板机Thermo；酶标分析仪Sunshine；吸水纸；塞内卡病毒间接ELISA抗体检测试剂盒购自兰州兽医研究所。生物安全柜Haier；离心机Thermo；实时定量荧光PCR仪QuanStdio 6 Flex；SimlyP病毒DNA/RNA共提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；塞内卡病毒荧光RT-PCR检测试剂盒购自达安科技；PBS溶液现用现配。
1.3 血清学检测方法
1.3.1 洗涤液的准备
使用前浓缩洗涤液用去离子水25倍稀释，可在2～8℃条件下保存7d。
1.3.2 样品的准备
用样品稀释液30倍稀释待检样品。每个样品在添加到反应板前应混匀。注意：不要稀释阴阳性对照。取样后需更换吸头。
1.3.3 血清抗体检测
按照塞内卡病毒间接ELISA抗体检测试剂盒说明书的要求进行操作。
1.3.4 结果判定
当S/P 0.4判定结果为阴性；当 S/P≥0.4判定结果为阳性。
1.4 病原学检测方法
1.4.1 样本处理
利用无菌镊夹取待检病死或屠宰猪的脾脏、肺脏、淋巴结、肾脏等组织2.0g于研磨器中充分研磨，加入PBS 10ml充分研磨混匀，将组织悬液转入1.5ml无菌离心管中3000rpm离心10min，离心取上清液转入Eppendoff管中，编号备用。鼻拭子、肛拭子放入盛有1.0ml PBS 的Eppendoff管中，编号备用。
1.4.2 病毒核酸的提取
参照SimlyP病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书进行操作。
1.4.3 病原学检测
按照A型塞内卡病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书进行操作。取N个（N=待测样本个数+阴性质控品+SVA阳性质控品）PCR反应管。按照以下扩增体系进行配置：
质量控制：
（1）阴性质控品：FAM检测通道无明显扩增曲线。
（2）阳性质控品：FAM检测通道有明显扩增曲线，且Ct值≤32
同时满足以上要求，实验成立。
（3）结果判定
若检测样品FAM通道无扩增曲线或Ct值＞38，判定样品为A型塞内卡病毒阴性；
若检测样品FAM通道无扩增曲线且Ct值≤38，判定样品为A型塞内卡病毒阳性。
2 结果与分析
2.1 SVA血清学检测结果
血清学共检测样本839份，结果显示：天津地区3个屠宰场SVA血清样本阳性样本数为0，抗体阳性率为0%（表3）。
表3 血清学检测结果
2.2 SVA病原学检测结果
病原学共检测样本404份，结果显示：天津地区3个屠宰场、2个无害化处理场SVA病料样本阳性样本数为0，阳性样本率为0%（表4）。
3 讨论
单纯使荧光定量RT-PCR方法检测猪塞内卡病毒，只能通过检测病毒核酸来直接检测病毒，这对正处于病毒感染阶段且体内具有一定病毒含量的个体是易于检出的，但对感染过程已经结束或者感染虽然持续存在但体内病毒含量很低的个体则难以检出，而抗体检测则可以解决这个难题，故两种方法联合使用无疑会使检测结果更加全面和准确。
本研究采用SVA血清学和病原学方法，对天津地区部分屠宰场和无害化处理场采集的血清样本、组织样本进行检测，结果显示，血清样本和组织样本中均未检出SVA阳性。高春柳[1]等利用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法，对华东、华南、华中、华北、西北、东北6个地区16个省市自治区屠宰场和非健康猪场采集的1310份组织样品和828份血清样品进行检测，结果显示，华东、华南、华中、华北、西北、东北地区组织样品阳性率分别为4.07%、17.06%、29.27%、0、2.65%、0，华东、西北地区血清样品阳性率分别为6.98%、15.17%，其中华北地区均为阴性，而华北地区采样集中在天津地区、河北省，未出现感染情况，与本研究所得出的结论一致，但华中、华南、华东等地区均有不同程度的感染。穆国冬等[2]人利用间接ELISA和荧光定量RT-PCR方法对吉林省7个县规模猪场和生猪屠宰场采集的420份样品进行检测，结果显示，抗体阳性率6.2%，病原阳性率4.8%，说明该病在吉林省已经出现区域性流行，具有一定的感染趋势。熊杰等[3]人利用实时荧光RT-PCR方法对攀枝花地区送检的100份血清进行检测，结果显示，所有样品均为SVA抗原阴性，说明攀枝花地区尚未出现SVA感染。
4 结论
本研究检测表明，天津地区猪塞内卡病毒病尚未出现感染，但该病目前没有商品化疫苗，绝不可掉以轻心，因此猪场要加强疫病的防控，做好科学的饲养管理和严格的生物安全措施。同时，有关部门和机构要高度重视该病的防控，加强检疫监管，开展回溯性研究和主动监测工作。
