艾叶乙酸乙酯提取物通过LINC01606/微小RNA-26b对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响

蒋学军，杨勇，庹磊，吉祖进，雷新益

中药在癌症的治疗中越来越多地发挥作用，研究表明，中药联合化疗在结直肠癌的治疗中发挥良好的效果，中药可提高病人免疫力，抑制癌细胞的增殖，对延长病人生存期、提高病人生存质量起一定的作用［1-2］。

艾叶为菊科蒿属植物艾的叶子［3］。研究发现，艾叶提取物对肝癌、胃癌、宫颈癌具有一定的抑制作用，且其呈明显的剂量依赖［4-5］，但艾叶提取物对结直肠癌的影响及其机制目前还不清楚。研究表明，微小RNA（miR）-26b 在人结直肠癌组织和耐药细胞株HT-29/5-氟尿嘧啶（5-FU）和LOVO/5-FU 细胞中表达水平下调，且miR-26b 在体外可提高结直肠癌细胞对5-FU 的敏感性，在体内增强了5-FU 对肿瘤生长的抑制作用［6］。而本研究通过预测发现，LINC01606 与miR-26b 之间存在结合位点。LINC01606在胃癌中高表达，与胃癌细胞迁移、侵袭有关［7］，在结直肠癌中的表达和转移尚不清楚。基于以上研究和预测结果，本研究于2018 年6 月至2019 年11 月以人结直肠癌细胞系SW1116 为研究对象，假设艾叶乙酸乙酯提取物通过调控LINC01606/miR-26b 途径影响结直肠癌细胞的增殖和凋亡，并对其进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料人结直肠癌细胞系SW1116购自美国模式菌种收集中心（ATCC）；艾叶药材来自湖北医药学院附属国药东风总医院中药房，经中药师鉴定为菊科植物艾的干燥叶；胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich 公司；Transwell 板购自美国Corning 公司；Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol、Realtime PCR 试剂盒、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自美国Invitrogen 公司；DMEM 高糖培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒和人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽（CCK-8）检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；LINC01606 过表达载体（pcDNA3.1-LINC01606）、LINC01606 抑制物（si-LINC01606）、miR-26b 模拟物（miR-26b）、miR-26b 抑制物（antimiR-26b）、空载体（pcDNA3.1）及阴性对照（miR-NC、anti-miR-NC、si-NC）购自苏州吉玛基因；周期素依赖激酶抑制剂p21（P21）、胱天蛋白酶-3（caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自英国Abcam；流式细胞仪购自美国BD 公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理 细胞培养：在含1%青-链霉素、10%FBS 的DMEM 高糖培养基中培养SW1116 细胞，置于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中培养至对数生长期，胰蛋白酶消化传代。药物处理：艾叶乙酸乙酯提取物采用文献［8］方法提取和制备。细胞过夜培养至贴壁状态时弃去培养液，加入含艾叶乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L浓度的DMEM 高糖培养液，分别称为实验1、2、3组，培养48 h，根据结果选择最佳处理浓度。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测LINC01606 和miR-26b 的表达 收集实验1、2、3 组的SW1116 细胞，Trizol 试剂提取细胞总RNA，逆转录合成互补DNA（cDNA），按Real-time PCR 说 明 书 合 成LINC01606 和miR-26b，95 ℃1 min；94 ℃30 s、59 ℃40 s、72 ℃42 s，35 个循环；72 ℃5 min。LINC01606 正向引 物：5'-GCTGGACATTTCTCCTTCA-3'，反向引物：5'-GAGTCCTCTCGCTTCCTCCT-3'；GAPDH 正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'；miR-26b 正 向 引 物：5'-CCCAAGCTTAAAAACCTCCACCACGAAT-3'，反 向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATTCAGG-3'；U6 正向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，反向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；运用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的SW1116 细胞用培养液稀释为1×l06～2×l06个细胞/毫升，接种于6 孔板（每孔200 μL 细胞）中培养。细胞融合度达到80%时，按照转染试剂说明书操作。将转染分组：LINC01606 过表达组（转染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-LINC01606），LINC01606 抑制+药物组（转染si-NC和si-LINC01606，然后用10 mg/L 艾叶乙酸乙酯提取物处理48 h）。转染48 h，收集细胞。

1.2.4 CCK-8 实验检测细胞增殖 将SW1116 细胞以5×103个/孔（100 μL）接种于96 微孔板中，培养24 h 至贴壁后，换培养液，加入含艾叶乙酸乙酯提取物12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 浓度的DMEM 高糖培养液继续培养48 h，每孔加入100 μL CCK-8 溶液，培养2 h，酶标仪测定450 nm 吸光度，细胞存活率%=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.2.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 收集各组SW1116 细胞并稀释，以5×104个/孔接种于6 孔板中，过夜贴壁后换为含艾叶乙酸乙酯提取物12.5、25、50 mg/L 浓度的DMEM 高糖培养液继续培养48 h，收集细胞用胰蛋白酶消化后依据凋亡试剂盒说明书操作。加入5 μL 标记的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和5 μL 碘化丙啶（PI）混匀，室温避光孵育20 min，加入缓冲液，流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.6 蛋白质印迹法 用放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解各组SW1116 细胞并超声破碎，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，封闭1 h。加入稀释的一抗（P21抗体1∶2 000、caspase-3 抗体1∶2 000 和GAPDH 抗体1∶4 000），4 ℃孵育过夜。等渗缓冲盐溶液（TBST）洗膜3 次，然后加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h。以GAPDH为内参照，分析蛋白水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 按照“1.2.3”的方法要求培养SW1116 细胞，将构建的lncRNA LINC01606 野 生 型（WT-LINC01606）和 突 变 型（MUT-LINC01606）双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC 或miR-26b 共转染SW1116 细胞，转染48 h后裂解细胞。以海肾荧光素酶活性为内参照，检测并计算裂解后的上清中相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计，结果均以± s表示。采用两独立样本t检验比较两组间数据差异，采用单因素方差分析比较多组间数据差异，采用SNK-q检验进行多组间的两两比较，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌细胞SW1116增殖和凋亡的影响与对照组相比，实验1、2、3 组的SW1116细胞克隆形成数、存活率和S期细胞百分比逐渐降低（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1 期细胞百分比均逐渐升高（P＜0.05），呈显著剂量依赖趋势，剂量越高效果越显著，见表1。说明艾叶乙酸乙酯提取物可抑制SW1116细胞增殖，促进细胞凋亡。

2.2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 中LINC01606、miR-26b表达的影响与对照组相比，实验1、2、3 组的SW1116 细胞中LINC01606 含量逐渐降低（P＜0.05），miR-26b 逐渐升高（P＜0.05），呈显著剂量依赖趋势，剂量越高效果越显著，见表2。选用实验3组抑制率约为50%的艾叶乙酸乙酯提取物浓度（50 mg/L）进行后续实验。

表2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116中LINC01606、miR-26b表达的影响/± s

表2 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116中LINC01606、miR-26b表达的影响/± s

注：①与对照组比较，P＜0.05。

组别对照组实验1组实验2组实验3组F值P值重复次数3333 LINC01606 1.01±0.06 0.76±0.05①0.51±0.05①0.34±0.04①100.90＜0.001 miR-26b 0.98±0.08 1.26±0.09①1.41±0.10①1.69±0.12①27.08＜0.001

2.3 过表达LINC01606 能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 增殖、凋亡的影响转染pcDNALINC01606 以实现过表达LINC01606，与对照实验3组+pcDNA3.1组相比，实验3组+pcDNA3.1-LINC01606组SW1116 细胞中LINC01606 含量显著升高，细胞克隆形成数、存活率和S 期细胞百分比均升高（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1期细胞百分比均降低（P＜0.05）。见图1，表3。说明过表达LINC01606 可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116细胞增殖和凋亡的影响。

2.4 抑制miR-26b 能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116 增殖、凋亡的影响与对照实验3 组+pcDNA3.1 组相比，实验3 组+pcDNA3.1-LINC01606组SW1116 细胞中miR-26b 含量显著降低P＜0.05），细胞克隆形成数、存活率和S 期细胞百分比均升高（P＜0.05），P21、caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率及G1 期细胞百分比均降低（P＜0.05），见图2，表4。说明抑制miR-26b 可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116细胞增殖和凋亡的影响。

表1 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡及细胞周期的影响/± s

表1 艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡及细胞周期的影响/± s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。①与对照组比较，P＜0.05。

组别对照组实验1组实验2组实验3组F值P值重复次数3333 P21 0.22±0.03 0.34±0.03①0.47±0.04①0.67±0.05①75.46＜0.001 caspase-3 0.14±0.02 0.26±0.02①0.38±0.03①0.59±0.04①133.91＜0.001克隆形成数120±10 101±9①79±8①56±6①32.15＜0.001存活率/%100.01±9.68 81.57±8.02①68.17±6.69①48.26±4.91①25.20＜0.001凋亡率/%8.19±0.93 13.37±1.21①17.94±1.47①24.36±1.69①77.08＜0.001 G1/%28.69±2.33 32.17±2.41①37.04±2.75①41.20±3.24①36.96＜0.001 S/%35.18±2.56 31.98±2.39①26.10±2.21①23.21±2.04①50.09＜0.001 M/%36.13±2.74 35.85±2.62 36.86±2.59 35.59±2.63 0.39 0.764

图1 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞P21、caspase-3蛋白表达的影响

图2 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞P21、caspase-3蛋白表达的影响

2.5 LINC01606 靶 向 调 控miR-26bTargetScan 预测发现miR-26b 序列中含有与LINC01606 互补的位点，见图3。双荧光素酶报告实验表明，与miR-NC组相比，miR-26b组的WT-LINC01606报告载体的荧光素酶活性（0.92±0.05 比0.29±0.03）显著降低（t=18.71，P＜0.001），MUT-LINC01606 报告载体的荧光素酶活性（0.95±0.06 比0.94±0.06）差异无统计学意义（t=0.20，P=0.848），说明两者存在靶向结合关系。qRT-PCR 结 果 发 现，pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-LINC01606 组、si-NC 组、si-LINC01606 组miR-26b 表达 水 平 分 别 为0.99±0.06、0.35±0.04、0.98±0.06、1.49±0.09，四组整体比较差异有统计学意义（F=154.81，P＜0.001）；过表达LINC01606 可下调miR-26b 的含量（P＜0.05），抑制LINC01606 可上调miR-26b 的含量（P＜0.05）。说明LINC01606 靶向调控miR-26b。

图3 TargetScan预测发现LINC01606靶向miR-26b

3 讨论

越来越多的研究表明，中医药联合化疗和放疗等方式可有效改善肿瘤病人预后［9］。艾叶是菊科蒿属植物艾的干燥叶子，在我国各地生长广泛，具有祛寒止痛、温经止血的作用，它的提取物包括挥发油类、黄酮类、三萜类、桉叶烷类等，具有抗氧化、抗菌抗病毒、抗肿瘤、肝胆保护和提高免疫力等功能［10］。蕲艾鞣酸可抑制肝癌细胞HepG2 细胞增殖并促进细胞凋亡［11］。艾叶乙酸乙酯提取物对乙肝病毒HBV 有限制的抑制作用［8］。本研究提取艾叶乙酸乙酯提取物并处理结直肠癌细胞，发现12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 艾叶乙酸乙酯提取物可抑制结直肠癌细胞SW1116 的克隆形成数，降低细胞存活率，提高细胞凋亡率和细胞中P21、caspase-3 蛋白含量，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，50 mg/L 的艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116 细胞的抑制率约为50%，验证了艾叶乙酸乙酯提取物的抗肿瘤作用，但其具体机制尚不清楚。

表3 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s

表3 过表达LINC01606能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。

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表4 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s

表4 抑制miR-26b能逆转艾叶乙酸乙酯提取物对细胞SW1116增殖、凋亡的影响/± s

注：P21为周期素依赖激酶抑制剂p21，caspase-3为胱天蛋白酶-3。

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有研究表明，miR-26b 在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织，miR-26b 的过表达可靶向抑制Zeste基因增强子人类同源物2（EZH2）表达，抑制癌细胞增殖、侵袭及迁移［12］。研究也发现，miR-26b在结直肠癌三个细胞系中表达显著降低，可通调控核因子E2 相关因子3（NFE2L3）促进结直肠癌恶性进展［13］，且miR-26b 在体内可增强5-FU 对肿瘤生长的抑制作用［6］。miR-26b 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等中低表达，miR-26b 发挥肿瘤抑制因子的作用，其过表达可抑制肿瘤细胞增殖，并可抑制胃癌的紫杉醇的化疗耐药性［14-18］。本研究通过TargetScan 预测发现，miR-26b 可能是LINC01606 的靶点。LINC01606在胃癌中表达水平升高，并通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调控癌细胞的转移和侵袭［19］。基于以上结果，本研究假设艾叶乙酸乙酯提取物可能通过调控LINC01606/miR-26b 途径抑制结直肠癌细胞的增殖，并促进细胞凋亡。本研究经检测发现，艾叶乙酸乙酯提取物可提高SW1116 细胞中miR-26b 的水平并降低LINC01606 的水平，呈显著剂量依赖性。本研究结果表明，过表达LINC01606 和抑制miR-26b 均可逆转艾叶乙酸乙酯提取物对SW1116 细胞增殖和凋亡的影响；而双荧光素酶报告系统结果表明，LINC01606 靶向负调控miR-26b。

综上所述，50 mg/L的艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌SW1116 细胞的抑制率约为50%，艾叶乙酸乙酯提取物可能通过调控LINC01606/miR-26b 抑制SW1116 细胞增殖，促进细胞凋亡。艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌具有潜在的抑制作用。本研究只进行了一种结直肠癌细胞的体外实验，下一步将进行动物模型体内实验，进一步为艾叶乙酸乙酯提取物对结直肠癌的抑制作用提供数据支撑。