耐盐菌的筛选鉴定及其降解性能分析

孙 晴， 陈 平， 李再兴， 陈晓飞， 张婉玉， 邢 茜， 祁浩杰

（1.天俱时工程科技集团有限公司， 河北 石家庄 050000；2.河北科技大学， 河北 石家庄 050091)

0 引言

随着我国工业化进程快速推进， 废水造成的污染也日益严峻[1]。 其中高盐废水占废水总排放量的5%以上，并且以每年2%的速度快速上升[2]。 高盐废水是指总盐(以NaCl 计)质量分数大于或等于1%的废水，其可使水体富营养化和土地盐碱化。此类废水主要来源于石油、造纸、印染、化工、制药、食品加工等生产领域， 其中含有大量有机污染物和高浓度无机盐[3-5]。 高盐、高浓度废水成分复杂、毒性大、难降解，其治理方法是制约工业发展的瓶颈问题[6]。

目前， 处理高盐度废水方法主要包括电化学氧化法、离子交换法、膜分离法、加热蒸发法和生物处理法[7-9]。化学法和物理法有一定的局限性，如运行成本高，处理效果有限，通常只在特定条件下应用，无法大规模工业化应用；生物处理法无需提前除盐，也无需稀释进水，可直接用于含盐废水的处理。该方法可减少前期的资金投入和后期的运营成本， 而且无二次污染、节约水资源，是处理废水的首选方法，也是近年来的环保热点[10-11]。但盐度过高容易破坏微生物细胞和胞内生物酶，抑制微生物的生长和代谢，无法达到理想的降解效果[12]。 因此，有研究人员将耐盐菌投加到活性污泥中或者生物反应器内进行应用。李坤等[13]研究发现，在MBBR 中接入耐盐菌剂，不仅提高了COD 去除率， 生物膜处理体系也更加稳定，能够抵抗较高盐度范围波动。 代鹏飞等[14]将优势菌投加到SBR 中发现，COD 平均去除率为72.8%，比未投加微生物组提高了22%。 廖焰焰等[15]从处理医药废水的活性污泥中驯化、 分离出一株高耐盐菌株发现，该菌株可处理高盐医药废水，CODcr 去除率可达73.0%。由上可知，耐盐菌的加入可改善盐度对微生物的抑制作用， 大幅提升高盐废水中有机污染物的降解效率。 高效耐盐菌在高盐废水处理中具有巨大的应用潜力[16]。

从某制药厂二沉池中取出活性污泥，通过驯化、分离得到3 株耐盐菌，最终筛选出一株高耐盐菌。对该菌株进行形态学、 生理生化特性和16S rDNA 分析进行菌株鉴定， 研究不同环境因素对菌株降解性能的影响，并在实际高盐废水中进行应用验证，以期为生物法处理难降解高盐废水提供高效菌种资源和技术支持。

1 材料与方法

1.1 培养基

基础培养基、全培养基、选择性培养基均参照文献《微生物学实验》[17]。 基础培养基用于细菌培养；全培养基用于细菌富集；选择性培养基用于细菌性能测定。

1.2 菌株筛选

驯化：实验搭建反应器模拟MBBR 工艺，模拟废水中（m(C)∶m(N)∶m(P)=100 ∶5 ∶1）底部曝气好氧运行。根据COD 去除率和驯化情况逐步提高盐浓度， 培养至填料挂膜情况良好， 镜检可见明显菌胶团，即得到定向驯化的耐盐菌群[18-20]。

筛选：用混匀器处理驯化后的污泥液，取上清液稀释后涂布于基础培养基上，在温度为30 ℃下培养至有明显菌落。 挑取不同单菌落多次划线培养至得到纯化细菌。 梯度配制NaCl 质量分数为0 ～15%的固体基础培养基。将纯化菌株制成菌悬液，稀释至合适倍数后涂布。 在30 ℃恒温下培养72 h，用菌落数量表示菌株生长情况[21]。

1.3 菌株鉴定

（1）菌株形态特征和生理生化特性。将菌株接种于基础培养基上培养，观察其菌落特征和菌体形态。参照《微生物技术》进行生理生化特性实验[21]。

（2）菌株16s rDNA 基因序列分析。用DNA 试剂盒提取细菌基因组DNA。 使用16S rDNA 通用引物进 行 PCR 扩增。 扩增引物为27F （5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3） 和 1492R （5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）， 扩增反应体系为50 μL。将扩增产物送上海派森诺基因科技有限公司完成16S rDNA 序列测定[22]。

1.4 菌株生长特性研究

为探究环境因素对复筛菌株的影响， 按照将菌悬液稀释至108 CFU/mL 接入选择性培养基， 分别设置好温度、pH 值、接种量和盐度梯度，在恒温培养振荡器以转速为190 r/min 培养72 h，每24 h 取样1次，分别测定OD600值和COD 浓度[23]。并在最适宜单因素条件下，测定细菌生长趋势[17]。

1.5 菌株降解高盐废水的实际应用

从细菌斜面上挑取一环菌苔接入基础培养基中，200 r/min 摇床培养过夜。 将得到的培养液，稀释至合适的接种浓度（108 CFU/mL）转接到全培养基中。 180 r/min 摇床培养24 h 得到放大培养的菌液。

菌株降解高盐废水实验装置示意见图1。由图1可以看出，该装置采用有机玻璃反应器，有效容积为3 L。 首先将某制药厂一车间和二车间的高盐废水分别加入1 号、2 号反应器中，调节pH 值至设定值，开启曝气泵，将DO 质量浓度控制在4 ～5 mg/L。 再将体积分数为5%菌液接入1 号、2 号反应器中， 每隔24 h 测定1 次COD 值。 同时，以普通活性污泥处理一车间和二车间的高盐废水作为对照实验，在3 号、4 号反应器中进行。

图1 降解高盐废水实验装置示意

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

污泥驯化启动初期， 测得NaCl 质量浓度为4 224 mg/L，COD 质量浓度为800 mg/L。 运行60 d后，NaCl 质量浓度达到40 000 mg/L，进水COD 质量浓度为2 000 mg/L，去除率稳定在82.5%以上。 填料挂膜情况良好，镜检菌胶团明显，得到定向驯化的耐盐菌群。

经过分离纯化得到3 株细菌，分别命名为M01，M02，M03。耐盐性测定实验结果见表1。由表1 可以看出，菌株M02 在NaCl 质量分数为0 ～12%的培养基上均能生长，说明该菌株具有耐高盐能力，对盐度有较宽的耐受范围。 微生物的耐盐能力是决定其在高盐废水中存活与繁殖的决定性因素，

表1 耐盐性测定实验结果%

2.2 菌株鉴定

（1）菌株形态特征和生理生化特性。 菌株M02的形态特征见图2。 由图2 可以看出，M02 菌落呈圆形边缘完整，表面有光泽、光滑、湿润、易挑起，不透明，呈白色，侧面观察为扁平状，48 h 内菌落直径为1.67 ～1.90 mm。 在1 000 倍显微镜下观察菌体形态呈短棒状，两端较圆滑，大小约为（2 ～4）μm× （3 ～6）μm。

图2 菌株M02 的形态特征

菌株M02 生理生化特性见表2。

表2 菌株M02 的生理生化特性

（2）菌株16S rDNA 测序。菌株M02 PCR 电泳图像见图3。

图3 PCR 产物电泳图像

将测序得到的序列结果用MEGA7.0 软件构建系统发育树见图4。 由图4 可以看出，M02 核苷酸序列与Stenotrophomonas pavanii 的同源性达到98%，2种菌株亲缘关系接近。 但本菌株的形态学特征和理化性质与已经报道的Stenotrophomonas pavanii 存在一定差异[24]，故鉴定为Stenotrophomonas pavanii 属的一株潜在新菌， 命名为Stenotrophomonas pavanii M02， 于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.22898。

图4 菌株M02 的系统发育树

2.3 菌株生长特性研究

温度对菌株M02 影响情况见图5。 由图5 可以看出，当培养温度为10 ℃时，菌株生长缓慢。随着温度升高， 菌株生长繁殖速度迅速提升，COD 去除率随之升高； 当温度升至30 ℃时， 细菌增长量最大，COD 最终去除率可达90.9%；当温度继续升至40 ℃时， 细菌生长速度明显减缓，COD 最终去除率也降至63.3%。 说明温度可显著影响细菌的合成代谢，当温度低时，细菌的生长和生化反应速率变慢。 温度每升高10 ℃，生化反应速率增加一倍[25]。 但温度不可能无限升高， 因为细胞内蛋白质和核酸等物质对温度极为敏感，过高温度将造成不可逆破坏，致使细菌死亡。 因此，确定菌株最适宜生长温度为30 ℃。

图5 温度对菌株M02 的影响

pH 值对菌株M02 影响情况见图6。由图6 可以看出，在偏酸性环境内细菌增量较低；在中性偏碱性环境内细菌增量明显变大， 当pH 值为7 ～8 时，COD 最终去除率均达到91%以上；在碱性环境内细菌生长速度再次减缓， 当pH 值分别为9，10 时，COD 去除率分别降低为85%和78%。 培养环境的pH 值可引起细胞膜电荷的变化，细胞膜电位改变不仅影响细菌对营养物质的吸收还改变了微生物体内各种生化酶的活性。细菌的生长受到抑制，去除率也随之降低。因此，为保证细菌生长且具有较高的降解潜力，确定最适宜培养pH 值为7 ～8。

图6 pH 值对菌株M02 的影响

接种量对菌株M02 影响情况见图7。 由图7 可以看出， 在培养初期， 接种量超过7%以上的OD600值增长速度明显高于其他对照组。 随着培养时间增长，接种量分别为10%和15%的OD600值逐渐减小，COD 去除率持续降低； 接种量为2%～7%的OD600值和COD 去除率稳定增长，在48 h 时COD 去除率分别为62.9%，86.2%，92.2%。 由此说明接种量过小停滞期延长；增大接种量，在前期可提高细菌生长速率，但随着培养时间延长，单位细菌可利用的基质和溶解氧相应减少出现菌体自溶，且菌体破裂后的胞内物使COD 浓度持续升高。 故在特定范围内，接种量越大去除效果越好。 因此，确定最适接种量为7%。

图7 接种量对菌株M02 的影响

盐度对菌株M02 影响情况见图8。 由图8 可以看出， 在不同盐度环境下，COD 去除率有着显著差别。 当NaCl 的质量分数为1%～4%时，细菌快速进入对数期，降解性能强，COD 最终去除率超过90%。随着盐度增加，菌株适应期延长，经过调整后继续生长， 但去除率明显降低。 NaCl 的质量分数为1%～12%时，菌株M02 均可生长且有降解性能，表明细菌耐盐范围广。在低盐度时，降解性能随着盐度的增加而增大； 当NaCl 的质量分数增至7%以上时，高盐浓度抑制了降解酶活性从而影响细菌的新陈代谢。 同时，在高渗透压的胁迫下细胞逐渐脱水，细胞质壁分离死亡。 因此，确定最适宜NaCl 的质量分数为1%～4%。

图8 NaCl 浓度对菌株M02 的影响

最适单因素条件下，细菌生长趋势见图9。 由图9 可以看出， 菌株M02 在2 h 内迅速进入对数期细菌量快速增长，在20 ～96 h 内为稳定期，细菌量保持在3.16×107～3.37×107CFU/mL。 该细菌延迟期短、生长迅速，对数生长期与稳定期相对长，在处理废水时可快速发挥作用， 持续且稳定地消耗有机污染物[26]。

图9 菌株M02 生长曲线

2.4 菌株降解高盐废水的实际应用

制药厂2 种废水的检测结果见表3。 图1 实验装置中的1 号、3 号反应器内为一车间高盐废水，2号、4 号反应器内为二车间高盐废水。其中1 号、2 号反应器按照2.3 生长特性研究得到培养条件， 将培养温度控制在30 ℃， 废水pH 值调节至7.5， 菌株M02 按照体积分数为7%的接种量分别接入2 个反应器内，曝气培养运行72 h。3 号、4 号反应器按照活性污泥法曝气培养运行72 h。

表3 高盐废水检测结果mg·L-1

2 种废水用细菌M02 和活性污泥法处理的效果对比情况见图10。 由图10 可以看出，一车间废水用菌株M02 处理时，24 h 的COD 去除率为55.3%，48 h 达到最大值92.0%， 而活性污泥法对COD 最大去除率仅为57.8%； 二车间废水用菌株M02 处理时，COD 去除率在72 h 内达到最大值93.8%，而活性污泥法对COD 最大去除率仅为33.9%。 2 种废水均为高盐水，活性污泥法对COD 的去除率均明显低于菌株M02， 因为高盐抑制了活性污泥中细菌的新陈代谢，甚至导致菌体死亡从而降低了有机物的降解率，而菌株M02 可在盐度为1%～12%之间生长且具有降解性能，处理药厂2 种废水的降解率均为92%以上， 再次印证该菌株在高盐条件下能够有效降解COD。 菌株M02 处理高盐废水72 h 时，二车间废水的去除率比一车间废水去除率高1.8%，说明在细菌最适耐盐范围内，有机物浓度增大，单位微生物可利用的底物增多， 有利于细菌的生长和有机物的去除。同样2 种废水用活性污泥处理时，盐度越高，降解性能越差。 以上说明菌株M02 在高盐环境中能够维持自身的新陈代谢， 可有效降低废水中COD浓度，处理效果显著优于活性污泥法，适合高盐工业废水的处理。

图10 菌株M02 与普通活性污泥对高盐废水降解的比较

3 结论

通过对处理制药废水的活性污泥进行驯化、筛选得到一株耐高盐优势菌株。经过形态学、生理生化实验和16S rDNA 序列分析， 确定该菌株为寡养单胞菌属的一株潜在新菌， 将其命名为Stenotrophomonas pavanii M02，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.22898。

菌株M02 可在NaCl 质量分数为0 ～12%的环境中生长，具有广谱耐盐性。采用单因素实验法研究不同培养条件对菌株降解模拟高盐废水的影响，确定最适宜培养条件：pH 值为7 ～8, 温度为30 ℃, 接种量为7%，NaCl 的质量分数为1%～4%。 该菌株延迟期短，对数生长期与稳定期长，在处理废水时可快速发挥作用，持续且稳定地消耗有机污染物。

将菌株M02 处理某制药厂2 个车间的高盐废水， 对COD 最大去除率分别为92.0%和93.8%，比活性污泥法对COD 去除率提高34.2%和59.9%。 在实际废水处理中，该菌株具有高效降解性能，可大幅提高生物法处理难降解高盐废水的效果， 对工业废水降解具有实际应用价值。