辣椒油树脂挥发性成分分析及其抗氧化活性研究

王莹莹，汪学德，王东营，苗红梅

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001；2.河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州 450002；3.河南省特色油料作物基因组学重点实验室(河南省农业科学院芝麻研究中心)，郑州 450002)

辣椒(CapsicumannumL.)，又名牛角椒，为茄科辣椒属草本类植物，原产于中南美洲[1]，在明朝时期引入我国，现大量种植于我国新疆、云南、贵州等地[2]。目前，我国已经成为世界最大的辣椒生产国、出口国、消费国[3]。辣椒油树脂(capsicum oleoresin)又称辣椒精、辣椒精油，通常是用有机溶剂索氏抽提后经真空浓缩得到的深红色黏稠状的液体，气味辛辣，流动性较小，不溶于水，易溶于丙酮、正己烷、石油醚等有机溶剂[4]。辣椒油树脂中含有辣椒色素类物质(如辣椒红色素、辣椒黄素、辣椒玉红素等)，以及大量的辣椒碱类物质(如高辣椒碱、二氢辣椒碱)[5]。辣椒碱是辣椒油树脂中的辛辣物质，用来提供辣味[6]。辣椒油树脂可应用于食品行业与精细化工领域。在食品中，辣椒油树脂主要用于生产日用调味料(如火锅底料、辣椒油等)以及腌制、调理食品中。辣椒油树脂也可进一步用于提取辣椒红色素与辣椒碱等精细化工产品。

截至目前，学者们对于辣椒油树脂的研究多集中于对其提取与纯化工艺的优化。在辣椒油树脂组成成分方面，刘佳等[7]以海南黄灯笼辣椒为原料，优化了超临界CO2法提取辣椒油树脂的工艺条件，并运用GC-MS对树脂的化学成分进行了分析。在辣椒油树脂抑菌及抗氧化活性方面，范三红等[8]以市售干红辣椒为原料，采用超声辅助法提取了辣椒油树脂，并以琼脂打孔法和自由基清除试验研究树脂的抑菌效果和抗氧化能力。然而，在辣椒油树脂化学成分及其表现出的抗氧化活性关联方面研究报道较少。

因此，为进一步探明辣椒油树脂的化学成分与抗氧化活性之间的关联，本文以贵州干红辣椒为原料，提取了辣椒油树脂，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，分析了辣椒油树脂中的挥发性化学成分，并对其抗氧化活性进行了探究。该研究为辣椒油树脂的高效利用提供了理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

干红辣椒(贵州条椒)：购于淘宝商城线上超市。

1.2 试剂

盐酸、三氯化铁、甲醇(均为分析纯)：天津科密欧化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)：美国Sigma公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ)、2,2′-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate),ABTS)：阿拉丁试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-6000PC紫外可见光分光光度计 上海元析仪器有限公司；KQ-300DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗器械有限公司；DVB-CAR-PDMS手动固相微萃取(SPME)进样器 美国Sigma公司；7890B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.4 试验方法

1.4.1 辣椒油树脂提取及挥发性成分分析

选用鲜干红辣椒，去蒂除籽后，采用粉碎机粉碎，过40目筛。称取80 g辣椒粉末，以丙酮为提取溶剂，进行索氏抽提，将提取液减压蒸馏，得到的暗红色黏稠状液体即为辣椒油树脂。

1.4.1.1 萃取方法

将3 g辣椒油树脂置于20 mL顶空瓶中，放入50 ℃水浴中平衡30 min；顶空萃取20 min，在气相色谱仪进样口热解吸5 min；随后进行GC-MS分析。

1.4.1.2 色谱条件

色谱柱为HP-5MS 毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)和VF-WAX MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升温程序：起始温度40 ℃，在40 ℃条件下保持3.5 min，以4 ℃/min的速率升温到230 ℃，保持8 min；以10 ℃/min 的速率升温至280 ℃，保持5 min。四级杆温度为150 ℃；载气为高纯氦气，流速为1.8 mL/min。

1.4.1.3 质谱条件

电子轰击(EI)离子源，电子能量 70 eV，传输线温度 280 ℃，离子源温度 230 ℃，四级杆温度 150 ℃，质量扫描范围(m/z)30～500，全扫描采集模式。

1.4.1.4 数据处理

采用 Agilent MSD化学工作站，将辣椒油树脂挥发性成分的GC-MS谱图与Agilent NIST 17质谱库进行比对。根据匹配度(≥80)和保留指数定性，并利用面积归一化法计算每种挥发性风味物质的相对百分含量。

1.4.2 辣椒油树脂抗氧化活性测试

1.4.2.1 DPPH自由基清除率测定

参照Ma等[9]的方法并稍加改动，测定DPPH自由基清除率。将辣椒油树脂与甲醇溶液混合，配制成不同浓度的辣椒油树脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)。随后，将0.5 mL不同浓度的辣椒油树脂溶液与3 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液混合均匀后避光反应30 min。采用分光光度计在517 nm处测定吸光度值(Asample)。甲醇溶液作为背景(Abackground)，以去除辣椒油树脂本身颜色对吸光度值的干扰。空白组为一级水(Ablank)，阳性对照为抗坏血酸(VC，100 μg/mL)。按下式计算DPPH·清除率：

DPPH·清除率(%)=[1-(Asample-Abackground)/Ablank]×100。

1.4.2.2 ABTS+自由基清除率测定

参考Pang等[10]的方法并稍加改动，测定ABTS自由基清除率。将ABTS与磷酸缓冲盐(PBS)溶液混合配制成7 mmol/L ABTS母液。将10 mL ABTS母液与178 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光反应12～16 h，即为ABTS储备液。

测定时，用PBS溶液稀释ABTS储备液，使ABTS反应液的吸光度在0.7±0.05。溶液配制完成后，将0.1 mL不同浓度的辣椒油树脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)与3.9 mL ABTS反应液混合，避光条件下反应10 min。使用分光光度计测量混合液在734 nm处的吸光度。一级水作为空白(Ablank)，抗坏血酸(VC，100 μg/mL)作为阳性对照。按下式计算ABTS+·清除率：

ABTS+·清除率(%)=(1-Asample/Ablank)×100。

1.4.2.3 总还原能力测定

参照Srivastava等[11]的方法并稍加改动，测定总还原力。吸取1 mL不同浓度的辣椒油树脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和1 mL 1%铁氰化钾溶液(K3[Fe(CN)6])，剧烈摇晃，使其混合均匀。50 ℃条件下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸，3500 r/min离心10 min。取上清液1.5 mL，依次加入1.5 mL一级水和0.15 mL 0.1%的FeCl3，继续反应10 min。采用分光光度计在700 nm处测定吸光度值，以抗坏血酸(VC，100 μg/mL)作为阳性对照。吸光度值表明还原能力的大小。

1.4.2.4 总抗氧化能力测定

根据Xu等[12]的方法测定铁离子还原能力(Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)。将FeCl3·6H2O(20 mmol/L)、TPTZ(10 mmol/L)和HCl(40 mmol/L)与乙酸盐的缓冲液(300 mmol/L，pH 3.6)按照1∶1∶10的比例混合来制备FRAP反应液。首先将FRAP反应液加热至37 ℃，然后将0.1 mL不同浓度的辣椒油树脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)与3 mL FRAP工作液和0.3 mL一级水混合，混合液反应4 min。使用分光光度计测量混合液在593 nm处的吸光度值。以抗坏血酸(VC，100 μg/mL)为阳性对照。根据上述方法，用Fe2+标准溶液代替样品，制备标准曲线(R2=0.9959)。精确计算FRAP值，校准曲线为每升该浓度辣椒油树脂样品的毫摩尔Fe2+当量。

1.4.2.5 数据处理

利用Excel 2016记录和分析试验数据，采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。

如图5所示，基于流体力学理论，采用有限元方法，建立二维几何模型来模拟毫秒激光对铝板的打孔过程。为简化计算过程，对模型提出如下假设：1) 将计算中涉及的流体作为不可压缩牛顿流体处理；2) 将金属蒸气作为理想气体处理，且对于入射的激光无影响；3) 铝液的沸点不受其他因素影响。

2 结果与分析

2.1 辣椒油树脂挥发性化学成分分析

为明确辣椒油树脂中的挥发性化学成分，对提取所得辣椒油树脂进行了HS-SPME-GC-MS分析。通过Agilent MSD化学工作站，将辣椒油树脂挥发性成分的GC-MS 谱图与Agilent NIST 17标准物质质谱库进行比对鉴定，根据匹配度(≥80)和保留指数定性，并利用面积归一化法计算每种挥发性风味物质的相对百分含量。结果显示，从贵州条椒样本中鉴定出了47种化合物，见表1。分别包括15种烷烃类化合物、13种萜烯类化合物、9种酯类化合物、5种醛类化合物、3种醇类化合物，以及2种呋喃类化合物。

表1 辣椒油树脂化学成分及相对含量表

2.2 辣椒油树脂体外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH基团具有单电子，是以氮为中心的一种稳定自由基，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm处有强吸收[13]。抗氧化剂可使体系褪色，从而减小吸光度值。因此DPPH·清除率可通过吸光度值的变化进行分析。

用不同浓度的辣椒油树脂溶液对DPPH·清除率进行检测，结果见图1。

图1 辣椒油树脂清除DPPH·能力

由图1可知，随着辣椒油树脂浓度的增大(0.6～3.0 mg/mL)，辣椒油树脂对DPPH·的清除率逐步提升。当辣椒油树脂浓度为0.6 mg/mL时，对DPPH·的清除率为21.1%。当浓度达到3.0 mg/mL时，对DPPH·的清除率达到了78.0%，并接近VC的作用效果(清除率为94.8%)。

2.2.2 ABTS自由基清除率

ABTS是测定亲脂性和亲水性物质抗氧化能力的一种间接方法，氧化后生成的蓝绿色ABTS+·可溶于水相及醇溶液中，在734 nm处有最大吸收峰[14]。样品中的抗氧化成分可与ABTS+·反应而使体系褪色，因此可根据吸光度值的变化计算出ABTS+·自由基清除率。

用不同浓度的辣椒油树脂溶液对ABTS+·清除率进行检测，结果见图2。

图2 辣椒油树脂清除ABTS+ ·能力

由图2可知，辣椒油树脂清除ABTS+·的能力随着浓度的升高而升高，在浓度为1.8 mg/mL时辣椒油树脂对ABTS+·的清除率为39.8%，超过了VC对该自由基的清除率(39.4%)；在浓度为3.0 mg/mL时辣椒油树脂对ABTS+·的清除率可达67.9%。

2.2.3 总还原力测定

还原力是以普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)的生成量为指标，样品中的抗氧化成分将Fe3+还原为Fe2+，再与FeCl3反应生成普鲁士蓝，在700 nm处有最大吸收峰[15]。因此，样品还原力可通过吸光度值的变化进行分析。

对不同浓度辣椒油树脂的总还原力进行检测，结果见图3。

图3 辣椒油树脂总还原力

由图3可知，辣椒油树脂总还原能力随着浓度的升高而升高，在浓度为0.6 mg/mL时，辣椒油树脂显示出的还原能力较低，为0.30。当浓度达到3.0 mg/mL时，辣椒油树脂的还原力为0.81。与对照VC相比，辣椒油树脂的还原能力相对较差。

2.2.4 总抗氧化能力测定

FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power)是一种在低pH条件下利用Fe2+与TPTZ生成蓝紫色复合物(在593 nm处有强吸收)来测定样品抗氧化能力的方法，广泛运用于食品的抗氧化能力分析[16]。

首先建立Fe2+溶液标准曲线(Y=0.9536X-0.0686，R2=0.9959)，用于精确计算FRAP值。随后，检测不同浓度辣椒油树脂溶液的总抗氧化能力，见图4。

图4 辣椒油树脂总抗氧化能力

由图4可知，辣椒油树脂总抗氧化能力随着浓度的增大而升高，在浓度为1.8 mg/mL时，FRAP值为0.51 mmol/L，已高于VC的总抗氧化能力(0.46 mmol/L)；在浓度为3.0 mg/mL时辣椒油树脂的FRAP值为0.77 mmol/L。

3 结论

本研究鉴定出了辣椒油树脂中47种挥发性化学成分，其主要化学成分(相对含量高于1.0%)为：甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)、糠醛(8.89%)、香橙烯(6.75%)、茴香脑(5.89%)、苯甲醛(5.48%)、γ-丁内酯(4.55%)、2-甲基十三烷(3.20%)、柠檬烯(2.57%)、月桂烯(2.05%)、癸烷(1.87%)、2-甲基四癸烷(1.26%)、(E)-β-罗勒烯(1.22%)、(2S,3S)-2,3-丁二醇(1.16%)、十一烷(1.10%)、2-甲基-1-十四碳烯(1.10%)共16种物质，占挥发性成分总量的89.70%。同时，在体外抗氧化活性测试中确定了辣椒油树脂具有良好的自由基清除能力、总还原能力及总抗氧化能力。

4 讨论

本文在贵州条椒的辣椒油树脂中检测出了47种挥发性化学成分，包括烷烃类、萜烯类、酯类、醛类、醇类以及呋喃类化合物。其主要组成成分及相对含量与已报道的样本存在一定的差异。例如：李洪福等[17]采用GC-MS分析了海南黄灯笼辣椒提取物的化学成分，结果表明辣椒提取物的成分为脂肪酸类、酰胺类、烷烃类、甾醇类以及维生素类化合物。纪良霞等[18]采用GC-MS对广西指天椒的乙酸乙酯提取物进行了成分分析，其主要组成成分为脂肪酸类、辣椒碱类、酯类、醇类以及呋喃类化合物。刘艳敏等[19]采用HS-SPME-GC-MS对贵州油辣椒中的挥发性风味成分进行了分析，其主要组成成分为萜烯类、醛类、酯类、醇类、酮类、烷烃类、呋喃类、吡嗪类、吡咯类和芳香烃类化合物。本试验从辣椒油树脂中鉴定出的相对含量最高的2种化合物为甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)，属于醛类和醇类化合物，这可能与所选用的辣椒样本、辣椒油树脂提取方法及成分分析方法有关。下一步将增加样本基因型，并对提取方法和分析方法进行比对，以进一步明确影响辣椒油树脂主要组成成分的因素。

此外，体外抗氧化测试结果证实了辣椒油树脂具备良好的抗氧化活性，该结果与以往其他类似研究结果较为相似。Tepe等[20]研究发现含有单萜化合物或者倍半萜的精油一般可表现出较好的抗氧化活性。Ruberto等[21]研究认为单萜烯类化合物表现出的抗氧化活性源自其中含有活泼的亚甲基基团，如α-蒎烯、柠檬烯、γ-松油烯、茴香烯等。本文中辣椒油树脂化学成分分析结果显示，单萜类物质在辣椒油树脂中的含量较高，该类物质对自由基具有良好的清除作用，因此，辣椒油树脂表现出较强的抗氧化活性。相比于抗坏血酸(VC)，辣椒油树脂的自由基清除活性与还原力要低一些，这可能与辣椒油树脂的纯度不够有关。但是抗坏血酸作为一种强抗氧化剂，天然提取物抗氧化能力存在逊色于抗坏血酸的情况，这在周江菊等[22]对樗叶花椒叶精油的抗氧化活性测定中也有体现。

今后将对辣椒油树脂化学成分与抗氧化能力之间的相关关系进一步开展研究，为揭示辣椒风味油脂的氧化稳定性及其风味物质变化规律奠定理论和技术基础。