2021年湖南省猪流行性腹泻病毒流行调查及M基因序列分析

周宇骏，杜雅萍，陈宇明，胡鹏辉，袁 智，龙明英，谭镜明

(1.湖南中科基因技术有限公司，湖南 长沙 410128 ； 2. 长沙市农业综合行政执法局，湖南 长沙 410128)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员，是导致仔猪腹泻的重要病原之一[1]。仔猪感染PEDV后可引起急性腹泻、呕吐和脱水等临床症状，且发病哺乳仔猪会出现极高的死亡率[1-2]。PEDV于1971年首次在英国报道，目前该病原已在全世界各地广泛流行，如欧洲、亚洲和北美洲等，给全世界生猪养殖业造成巨大经济损失。

PEDV属于有囊膜、单股正链RNA病毒，其基因组大小约28 kb，可编码多个结构蛋白，其中包括纤突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)，其中M蛋白参与病毒粒子组装和出芽等过程，同时可诱导机体产生相应的中和抗体[3]。当前全世界流行的PEDV毒株可分为2种基因型(G1和G2)，但不同基因型PEDV毒株之间M基因相对保守，研究人员可以使用该基因分析田间毒株的遗传多样性，以此为疫苗的选择与进一步防控提供依据[2,4]。

近年来，湖南省生猪养殖水平逐渐提高，但PEDV在该地区猪场仍广泛流行。本试验于2021年1—12月在湖南省部分地区213个发生严重腹泻猪场采集样品1 406份，以实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)方法检测PEDV流行情况 ； 并对22份阳性样品M基因进行测序与分析，旨在了解当前湖南省PEDV感染情况和流行的基因型，为制定有效的防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2021年1—12月，从湖南省衡阳、邵阳、永州、益阳、郴州、长沙等14个州市213个腹泻猪场采集猪腹泻样品共1 406份，其中棉拭子、粪便和肠组织或内容物样品数量分别为507、443份和456份。无菌采集样品，低温送至湖南省中科基因有限公司，保存于-80 ℃，待检。

1.2 主要试剂 FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA基因组提取试剂盒，购自济凡生物科技(常州)有限公司；2× T5 Super PCR Mix、DL2 000 DNA Marker和琼脂糖粉末等，均购自湖南擎科生物有限公司；cDNA反转录试剂盒，购自宝日医生物技术(北京)有限公司；猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒，购自广州维伯鑫生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank收录的PEDV毒株M基因序列，使用NCBI网站中Primer BLAST软件在线设计扩增M基因片段的特异性引物，引物序列为：M-F：5′-TCCCGTTGATGAGGTGATTGAA-3′，M-R：5′-GTCCATAGACAATTGTTGTAG-3′，引物委托长沙擎科生物有限公司合成。

1.4 病原检测及PEDVM基因扩增 将灭菌研磨棒和研钵置于冰上冷却，取适量样品(如组织、粪便或拭子)置于研钵内，加入2 mL灭菌生理盐水，充分研磨；将混合液倒入2 mL离心管中，在4 ℃条件下高速(10 000 r/min)离心2 min，取200 μL上清用于病毒RNA基因组提取，其操作步骤按照试剂盒说明书进行。使用cDNA反转录试剂盒将病毒RNA反转录为cDNA，保存于-20 ℃。以cDNA基因组为模板，使用PEDV核酸检测试剂盒对病原进行检测。

以部分PEDV阳性样品cDNA基因组为模板，以反转录PCR(RT-PCR)法对其M基因序列进行扩增，反应体系(50 μL)：2×PCR预混液25 μL，上、下游引物各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL和无RNA酶水18.0 μL；反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃ 7 min。反应结束后，取5.0 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性产物送至长沙擎科生物有限公司进行测序。

1.5 PEDV毒株M基因序列分析 从GenBank数据库中下载具有代表性的PEDV毒株M基因序列，应用DNASTAR 7.0软件对获得序列进行核苷酸和对应氨基酸同源性分析；此外，使用MEGA 7.0软件中邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，以分析不同毒株所属基因型。

2 结果

2.1 腹泻仔猪临床观察及病理剖检 本试验采集的腹泻样品大部分来自于仔猪或保育猪，其中仔猪腹泻临床症状及病理变化如图1所示，腹泻仔猪体型消瘦，皮肤多处被粪污污染(图1A)；粪便为灰黄色，因持续腹泻导致肛门肌肉松弛；进一步剖检可发现腹泻仔猪小肠肿胀扩张，肠壁变薄且无弹性，肠道内充满黄色液体(图1B)。

图1 仔猪腹泻临床症状及剖检症状

2.2 PEDV流行病学调查 2021年1—12月，本试验从湖南省不同地区共213个猪场采集疑似感染PEDV样品共1 406份，经检测发现85个猪场中存在PEDV阳性猪群，场阳性率为39.91%；303份样品为PEDV核酸阳性，平均检出率为21.55%。不同类型样品检出率差异较大，其中棉拭子样品检出率最低，为14.40%；肠组织或内容物检出率最高，为29.39%；而腹泻粪便检出率为21.67%(表1)。不同发育阶段腹泻猪群样品检出率中以仔猪和保育猪最高，分别为25.95%和20.26%，而育肥猪和繁殖母猪检出率分别为11.56%和9.30%(表2)。进一步分析不同季节结果发现，春季和冬季来源样品PEDV检出率较夏季和秋季高，分别为25.05%、24.21%和15.91%、12.71%(表3)。

表1 不同类型样品PEDV病原检测

表2 不同发育阶段腹泻猪群PEDV病原检测

表3 不同季节PEDV病原检测

2.3 部分PEDV阳性样品M基因RT-PCR扩增 采用RT-PCR方法对22份PEDV阳性样品M基因进行扩增，均得到与预期片段大小一致的目的片段。部分凝胶电泳结果如图2所示，15个阳性样品均扩增出约520 bp的条带，与预期大小一致，且阳性对照和阴性对照均成立。

图2 部分PEDV阳性样品M基因序列扩增

2.4 PEDV毒株M基因序列遗传进化分析 将22份PEDV阳性样品M基因扩增产物进行双向测序，其后对测序结果进行拼接。结果显示，22个毒株M基因扩增序列大小一致，均为525 bp。根据样品来源将22个毒株M基因序列分别命名：CH/HNLY1-2(湖南浏阳)、CH/HNCS(湖南长沙)、CH/HNZZ1-2(湖南株洲)、CH/HNHH(湖南怀化)、CH/HNCZ(湖南郴州)、CH/HNSY1-3(湖南邵阳)、CH/HNCD(湖南常德)、CH/HNYY1-2(湖南岳阳)、CH/HNYiY1-2(湖南益阳)、CH/HNYZ(湖南永州)、CH/HNHY(湖南衡阳)、CH/HNXT1-2(湖南湘潭)、CH/HNLD(湖南娄底)、CH/HNXX(湖南湘西)和CH/HNZJJ(湖南张家界)。

将获得的22个毒株与GenBank数据库下载的PEDV毒株M基因序列共同构建遗传进化树，结果显示，所有PEDV毒株在进化树上可分为2个大分支，分别为Genotype I(传统株)和Genotype II(变异株)；本试验获得的22个PEDV毒株中有19个毒株属于变异株，与国内流行的变异株AJ1102和GDA等毒株相距较近，剩余3个毒株属于传统株，与PEDV CV777疫苗株和国内早期分离毒株(如CHS)相距较近。以上结果表明，湖南省流行的PEDV毒株基因型相对复杂，同时存在变异株和传统株，但变异株仍然是优势毒株。

图3 基于PEDV M基因序列构建遗传进化树

2.5 PEDV毒株M基因序列同源性分析 将本试验获得的22个毒株与参考毒株M基因核苷酸序列进行同源性分析。结果显示，22个毒株之间同源性为97.8%～100.0%，与国内外流行PEDV毒株对应序列同源性为96.8%～100.0%；其中CH/HNCS、CH/HNSY-2和CH/HNYY-1毒株与国内流行传统株(CHS)和疫苗株(CV777)较其他19个毒株同源性更高，分别为99.1%～99.4%和99.4%～99.7%，与PEDV变异株(如AJ1102和GDA)同源性为98.1%～98.6%；其他19个毒株与PEDV变异株(如AJ1102和GDA)M基因序列同源性最高，为99.4%～100.0%。

3 讨论

近年来，湖南省生猪养殖业发展迅速，且养殖水平有较大的提高，但猪流行性腹泻仍然是影响该地区养猪业健康发展的主要疾病之一，且仔猪持续腹泻给我国养猪业造成巨大的经济损失[5]。根据PEDV基因组变异情况，当前可将国内外流行的毒株分为2个基因型，分别为Genotype I(传统株)和Genotype II(变异株)，其中我国流行的大部分毒株为变异株，但部分地区同时存在变异株和传统株的流行[2,6]。已有大量研究表明，基于PEDV CV777株研发的疫苗对当前流行的变异株防控能力有限，因此了解猪场流行PEDV毒株基因型对疫苗选择和疫病防控措施制定与实施十分重要[7]。

本试验对湖南省不同地区213个猪场送检的1 406份疑似感染PEDV临床样品进行检测，发现PEDV场阳性率为39.91%(85/213)，样品平均阳性率为21.55%(303/1 406)，这表明PEDV仍然广泛流行于湖南省各地区，但其检出率较Tan等于2017—2018年的调查结果低(48.76%,59/121)[8]，笔者猜测可能存在多种原因：(1)本试验调查数据样品种类更丰富，数量更多；(2)为有效防控非洲猪瘟疫情，各猪场提高了饲养管理和生物安全水平，这在一定程度上也有利于猪流行性腹泻的防控；(3)有多种新发病原在湖南省不同地区流行，导致猪群腹泻的病因较以前更为复杂，如猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)，这使得腹泻样品中PEDV检出率相对较低。进一步分析结果显示，肠组织或内容物(29.39%)和腹泻粪便(21.67%)样品较棉拭子(14.40%)检出率更高，这可能提示肠组织(或内容物)和腹泻粪便更加容易检测腹泻相关病原(如PEDV)，由于棉拭子蘸取粪便量有限，且在运输过程中容易干燥或病毒灭活，这可能降低病原检出率。有研究表明，PEDV感染可提高繁殖母猪的流产率和返情率等，并会降低分娩率和胎产总仔数等，且可以影响育肥猪的生长性能[9]，而本试验也发现部分腹泻繁殖母猪和育肥猪来源样品中存在PEDV，说明PEDV可感染育肥猪和繁殖母猪，应引起重视。

为进一步分析湖南省流行PEDV毒株的基因型和遗传变异情况，本试验从湖南省不同地区部分猪场随机选择22份PEDV阳性样品M基因序列进行扩增与分析。结果显示，湖南省PEDV流行株基因型较复杂，同时存在变异株和传统株，但变异株仍然是优势株，这与Tan等调查结果一致[8]。基于M基因序列同源性分析结果显示，湖南省流行毒株出现不同程度的变异，但由于该基因在病毒进化过程中相对保守，为进一步分析流行毒株的变异情况，还需要对其他变异速率相对较快的基因片段进行扩增与分析，如S基因和ORF3基因等[1-2,10]。