非洲猪瘟病毒A104R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

蒋亚君，王召阳，崔 帅，王 洋，鑫 婷，郭晓宇 ，刘雪婷，陈世钰，房立春，朱鸿飞，贾 红

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 海淀 100193 ； 2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510630 ；3.山东省农业科学院，山东 济南 250100)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度传染性疾病，可导致患猪出现高热、出血、共济失调、严重抑郁等症状[1]，高毒力毒株对家猪的致死率可达100%。由于目前缺乏有效的商业疫苗和特异性疗法，该病给全球养猪业造成了巨大经济损失。

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的成员，为直径约200 nm的大型包囊病毒，基因组由170～193 kb的双链DNA组成，包含超过150多个开放阅读框，可编码54个结构蛋白和一些非结构蛋白[2]。A104R蛋白(pA104R)位于病毒核仁，主要出现于感染后期，是ASFV主要DNA结合蛋白之一，其结合活性稳定，结合位点的大小为14～16 nt，蛋白表达可在感染后16 h达到最大峰值[3]。研究显示，pA104R参与病毒转录、复制和基因组包装，抗体反应性好，是研究类核形成和基因组组装过程的理想靶点，也可作为ASFV疫苗研究的重要靶标蛋白[4-6]。

本研究通过基因合成获得ASFV的A104R基因，将其连接至pET-28a(+)载体，成功构建pET-28a-A104R原核表达系统，并制备了反应性和免疫原性良好的多克隆抗体，以期为进一步研究pA104R的生物学功能及ASFV疫苗和诊断试剂的开发提供生物材料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 pET-28a(+)载体，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；pMDTM18-T载体、EcoR I、XhoI限制性内切酶，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；T4连接酶，购自New England Biolabs (Beijing), lnc公司；2×Phanta Max Master Mix和BL21(DE3)感受态细胞，均购自南京诺唯赞生物技术有限公司；蛋白质分子质量标准(26616)和BCA蛋白定量试剂盒，均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量提取试剂盒，均购自康宁生命科学(吴江)有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)诱导剂和TanonTMHigh-sig ECL Western Blotting Substrate(ECL发光液)，均购自上海天能科技有限公司；KPL SureBlueTMTMB Microwell Peroxidase Substrate(TMB显色液)，购自北京西美杰科技有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG和HRP标记羊抗猪IgG抗体，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜，购自宝生物工程(大连)有限公司；Ni亲和层析柱，购自通用电气(GE)公司。ASF阳性血清，由中国动物疫病预防控制中心三级实验室灭活后申请传出。

1.2 主要仪器 超声破碎仪，北京德泉兴商贸有限公司产品；AKTA purifier蛋白纯化仪，格来赛生命科技(上海)有限公司产品；AB SCIEX MALDI TOF-TOFTM5800 Analyzer质谱分析仪，上海SCIEX分析仪器贸易有限公司产品。

1.3 实验动物 SPF级BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：北京百善SCXK(京)2021-0006。

1.4 试验方法

1.4.1A104R基因合成 根据GenBank中ASFV Georgia 2007/1的A104R基因参考序列(GenBank 登录号：MN393476.1)，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因合成，基因全长315 bp，理论编码蛋白大小为11.6 kDa。

1.4.2 pA104R序列生物信息学分析 根据 ASFV 参考蛋白序列(GenBank 登录号：QIE06827.1)，利用蛋白质理化性质预测软件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)、蛋白质信号肽预测软件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、蛋白质抗原决定簇预测软件Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl) 、蛋白质核定位信号预测软件cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)等在线软件对pA104R进行生物信息学分析[7]。

1.4.3 重组原核表达载体的构建 依据A104R基因序列，采用DNAMAN软件设计引物，并在上、下游引物中分别引入EcoR Ⅰ和XhoⅠ 酶切位点及其对应的保护性碱基，引物序列为：上游引物 ASFV-A104R-F:5′-CCGGAATTCATGTCGACAAAAAAA-AAGCC-3′(EcoR Ⅰ);下游引物ASFV-A104R-R:5′-CCGCTCGAGGTTTAACATATCATGGACAGGTT-3′(XhoⅠ)；引物由金唯智生物科技有限公司合成。将合成基因连接至pMD18T载体，并以此为模板，利用上述引物通过PCR扩增ASFVA104R基因片段，用胶回收试剂盒回收目的片段，将胶回收产物与pET-28a(+)载体DNA分别进行EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切后经T4连接酶进行连接，转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，次日挑取单菌落扩增，送金唯智生物科技有限公司测序。将测序正确的重组菌命名为pET-28a-A104R/BL21，提取质粒进行双酶切鉴定。

1.4.4 重组pA104R(rA104R)诱导条件优化及可溶性分析 将活化后的重组菌(1∶100)接种于LB液体培养基(卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃培养至OD600 nm达0.6～0.8时，加入IPTG(1 mmol/L)于37 ℃振荡诱导表达，并在培养后每2 h收集1 mL菌液制样，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达情况，取表达量较高时间点的菌液超声破碎，离心后分别收集沉淀和上清，对表达产物的可溶性进行分析。

1.4.5 rA104R重组蛋白纯化和Western blotting(WB)鉴定 重组菌活化、大量诱导表达，收集菌体，冰浴中超声破碎后收集上清并过滤，参考镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明书进行纯化，纯化的重组蛋白命名为rA104R。采用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。

取纯化的rA104R进行SDS-PAGE，转PVDF膜，5%脱脂乳37 ℃封闭2 h，以ASF阳性血清(1∶100)为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG(1∶5 000)为二抗分别进行孵育，ECL发光液显色。

1.4.6 rA104R液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析 将rA104R制样后进行SDS-PAGE，切取目的条带，参照参考文献[8]处理样品，制备好的样品经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDAI TOF-MS)分析，质谱数据使用GPS Explorer(V3.6)和MASCOT(2.3)进行搜索分析。

1.4.7 鼠源抗rA104R多克隆抗体制备 取纯化后的rA104R 50 μg与等量弗氏完全佐剂混匀乳化后，采用腹部皮下多点注射的方法免疫小鼠，第2周和第4周以相同剂量的rA104R与弗氏不完全佐剂混匀乳化后加强免疫，三免1周后采血，收集血清。

1.4.8 鼠源抗rA104R多克隆抗体WB鉴定 操作同1.4.5，以免疫小鼠血清(1∶1 000)为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG(1∶5 000)为二抗，ECL发光液显色。

1.4.9 鼠源抗rA104R多克隆抗体效价检测 采用方阵滴定法将纯化的rA104R倍比稀释后包被酶标板，将制备的多克隆抗体进行2倍倍比稀释作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)为二抗，经TMB避光显色20 min，2 mol/L H2SO4终止后测定OD450 nm处吸光值。

2 结果

2.1 pA104R序列生物信息学分析 利用1.4.2中在线软件进行预测，ExPASy预测结果显示，该蛋白氨基酸为104个，分子量为11 608.74，理论等电点为10.22，不稳定指数为33.41，总平均亲水性为-0.435。如图1所示，pA104R存在信号肽的可能性为0.000 6；pA104R有5个抗原决定簇；软件cNLS Mapper分析结果如图2所示，该蛋白具有9个核定位信号(NLS)基团，其Cut-off值分别为3.7、2.3、2.7、2.7、2.6、3.7、2.5、2.6、2.9。

图1 pA104R信号肽预测

图2 pA104R核定位信号预测

2.2 原核表达载体的双酶切鉴定 测序正确的重组菌提取质粒，进行EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切，如图3所示，出现预期大小的2个条带，分别为5 000 bp和315 bp，表明构建的pET-28a-A104R重组质粒正确。

图3 重组质粒pET-28a-A104R双酶切鉴定

2.3 rA104R诱导条件优化及可溶性分析 根据1.4.4方法进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，pET-28a-A104R/BL21在37 ℃诱导8 h后表达量最高，在上清和沉淀中均有蛋白表达，表明该蛋白呈现可溶性和包涵体2种表达形式。

图4 rA104R的诱导表达(A)和可溶性分析(B)

2.4 rA104R纯化和WB鉴定 纯化的rA104R经BCA定量检测，浓度为0.371 mg/mL，随后进行SDS-PAGE分析和WB鉴定。SDS-PAGE结果如图5A所示，出现较为单一的目的条带，大小约为16 kDa，与预期结果一致；WB结果如图 5B所示，rA104R可与ASF阳性血清反应，反应原性良好，可用于后续试验。

图5 纯化rA104R的SDS-PAGE分析(A)和WB鉴定(B)

2.5 rA104R的LC-MS分析 将获得的原始质谱数据用Proteome Discoverery软件、Mascot搜索引擎进行本地化数据库检索，如图6所示，肽段QELYSLVAADTQLINKA、IFTSQQK、IIQNALK、HNQEVIIPPGIKFTVVTVK、QGHNPATCEPIQIK均与目标蛋白片段氨基酸序列匹配(红色字母)，其氨基酸序列匹配覆盖度为59%，表明rA104R表达正确。

图6 rA104R的氨基酸序列匹配

2.6 鼠源抗rA104R多克隆抗体的WB鉴定 rA104R经SDS-PAGE后转膜，以制备好的多克隆抗体为一抗，进行WB鉴定，结果如图7所示，出现单一目标条带，表明该多克隆抗体可特异性结合rA104R。

图7 鼠源抗rA104R多克隆抗体的WB鉴定

2.7 鼠源抗rA104R多克隆抗体效价检测 经间接ELISA方法检测分析，rA104R的最佳包被浓度为2 μg/mL；根据免疫血清与阴性血清比值(P/N)分析，鼠源抗rA104R多克隆抗体效价大于2 048 000(图8)，表明纯化的rA104R具有良好的免疫原性。

图8 鼠源抗rA104R多克隆抗体效价检测

3 讨论

ASF可感染所有品种、年龄的野猪和家猪，可通过直接接触感染动物或间接接触污染物、感染的猪肉产品及软蜱等媒介进行传播，高毒力毒株对家猪致死率可达100%，对全球养猪业造成了重大影响[9-11]。目前针对ASF尚无获得批准的疫苗和药物，仅依靠早期检测、严格的生物安全措施以及动物扑杀等方式进行防控。

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的成员，可编码150～167种蛋白，这些病毒蛋白参与病毒核苷酸代谢、转录、DNA复制和修复以及宿主免疫调节等众多功能[12-13]，但很多的蛋白功能还未知。pA104R是在病毒复制晚期表达的DNA结合蛋白，存在于病毒颗粒的类核中，与DNA的结合可能会产生拓扑张力，与P1192R结合时可展示出DNA超螺旋活性[5]。研究表明，经siRNA敲除ASFV-Ba71V 株的A104R基因后，病毒复制子减少、基因拷贝数降低、ASFV编码的p72基因的mRNA水平也降低，表明A104R基因在病毒复制和基因表达中具有重要作用[5,14]。在慢性感染的无症状动物中，研究人员也检测到较高的A104R抗体反应，表明该蛋白有望用于疫苗及检测方法的开发[15]。

原核表达系统制备抗原的方法简单高效，应用成熟，且有助于提高抗原纯度和浓度，原核表达产物制备的抗体也具有较好的特异性和反应活性[16]，本研究利用生物信息学分析，预测pA104R理化性质、信号肽信息、核定位信号等信息后，将A104R基因连接至pET-28a(+)载体进行原核表达，成功获得rA104R，并制备了鼠源抗rA104R多克隆抗体。为更进一步验证蛋白的正确表达，本研究采用了具有强分离能力、高灵敏性、选择性和准确性的色谱-质谱联用技术[17]对表达产物进行鉴定，rA104R的多个多肽与目标片段氨基酸序列匹配，表明rA104R正确表达。纯化的rA104R浓度为0.371 mg/mL，蛋白表达量不高，可能与蛋白纯化方式有关，也可能与A104R基因转录水平相关，有待进一步验证。WB试验证明制备的rA104R可与ASF阳性血清发生反应，表明其反应性良好，可为后续ASFV诊断方法开发提供生物材料。本研究中考虑到小鼠作为实验动物更易获得，且经小鼠制备的多克隆抗体所需抗原量小、周期短、抗体滴度可满足单克隆抗体制备、间接免疫荧光等试验的需要，因此选择BALB/c小鼠进行免疫。本研究制备的鼠源rA104R多克隆抗体效价大于2 048 000，具有较好的免疫原性，可用于下一步试验。由此可见，本研究制备的rA104R及其多克隆抗体可用于蛋白生物学功能研究、ASFV相关免疫保护机制研究以及ASFV相关诊断方法的开发。