IgA肾病细胞模型中的炎症表达及丙戊酸钠的抗炎作用

戴 芹，王伟铭

1.复旦大学附属徐汇医院肾内科，上海 200031；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院肾内科，上海 200025

IgA肾病是以多聚体IgA1系膜区沉积、系膜细胞增殖、细胞外基质合成增加以及炎性细胞（包括巨噬细胞、单核细胞以及T细胞）浸润为特征的自身免疫性疾病［1］。低糖基化IgA1（glycosylation deficiency IgA1，Gd-IgA1）在循环中增多，并在系膜区沉积是IgA 肾病的重要特征［2］。我们的既往研究［3］发现，IgA 肾病患者血浆Gd-IgA1 浓度越高，尿蛋白的量则越多。Gd-IgA1 分子的血清浓度与肾小球组织损害程度也密切相关［4］，IgA 肾病的病理表现亦和预后相关［5-7］。上述研究结果均提示血浆中Gd-IgA1 浓度与IgA肾病严重程度密切相关。

Gd-IgA1 通过自身积聚或者与自身抗体IgG 结合形成免疫复合物沉积在肾脏引发肾脏损伤［8］。系膜细胞受到损伤后会出现系膜细胞肥大、增殖和系膜基质扩张等生物学反应［9］。Gd-IgA1在系膜区沉积后继发的炎症、细胞增殖和细胞外基质的合成导致了IgA肾病的进展［10］。INOUE 等［11］通过ddY 小鼠研究发现：在不影响其血清IgA 浓度的情况下，抑制其肾组织中的炎症可以延缓IgA 肾病的纤维化，改善IgA 肾病的预后。

本研究通过体外IgA 肾病细胞模型，应用人炎症因子蛋白芯片检测系膜细胞培养上清液中的炎症因子表达，并用组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylation，HDAC）抑制剂丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）进行干预，观察其在IgA 肾病细胞模型中的抗细胞增殖和抗炎作用，希冀从表观遗传学角度为防治IgA 肾病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞

人系膜细胞（human renal mesangial cells，HMCs）购于ScienCell研究实验室（美国）。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 Jacalin/Agarose IgA1（Sigma，美国），丙戊酸钠（Sigma，美国），人炎症因子抗体芯片3 （AAH-INF-GS3-16；Raybiotech，美国），βactin rabbit mAb （HRP conjugate；CST，美 国），HDAC1（mouse monoclonal；CST，美国），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（ANOGEN，加拿大），其他常规试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2.2 主要仪器 超净台（1300系列A2；Thermo公司，美国）；细胞培养箱（D-63450 Hanau；Heraeus公司，美国）；倒置相差显微镜（XSZ-D2；重庆光学仪器厂）；STS-2 型脱色摇床（上海斯特分析仪器有限公司）；低温超速离心机（Eppendorf 公司，德国）等。

1.3 方法

1.3.1 亲和层析法分离健康对照和IgA肾病患者中的IgA1 按照产品说明书操作，具体细节可参照我们的既往研究［12］。

1.3.2 细胞培养

（1）细胞的干预方法 将状态良好的HMCs按照1×105个/孔均匀种在6孔板或10 cm培养皿内。观察细胞长至80%～90%融合时，加入含1%FBS的DMEM培养液，培养12 h 后，分别加入不同类型的IgA1 及同体积的PBS（对照组），或者VPA 预处理1 h。24 h 后收集培养上清液至无菌EP 管中−80 ℃保存待用。细胞用胰酶消化后PBS液洗2次，然后提取总蛋白。

（2）MTT 细胞增殖实验 收集对数期细胞，调整细胞悬液密度为104～105个/mL，布板前反复吹打细胞悬液，尽可能使细胞均匀，以100 μL/孔加入细胞悬液，边缘孔用无菌PBS 100 μL/孔填充。5%CO2、37 ℃孵育，至细胞贴壁后吸弃含10%FBS的DMEM，重新加入含有不同干预成分的1%FBS 的DMEM 培养液，同时设置调零孔、对照孔，设5 个复孔。5%CO2、37 ℃孵育20 h。每孔加入10 μL MTT 溶液，继续培养4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养液。每孔加入150 μL MTT 溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm 处测量各孔的吸光度值。

1.3.3 AAH-INF-GS3-16 芯片操作流程 本实验共分为5 组： N-IgA1 组、 N-aIgA1 组、 P-IgA1 组、P-aIgA1以及无干预成分的仅含同体积PBS的对照组。玻片芯片完全干燥，加样，封闭，孵育1 h；按操作说明清洗芯片；每孔加入80 μL 配置好的生物素标记抗体（16 孔）；室温2 h；清洗后每孔加入70 μL 的1 500倍稀释的荧光剂−链霉亲和素，避光密封4 ℃过夜孵育。第2 日清洗芯片，拆除后再次清洗；放入离心机，甩干液体。用芯片扫描仪GenePix 4000B Microarray Scanner 扫描信号（扫描参数：PMT，650；波长532 nm；分辨率10 μm）。

1.3.4 免疫印迹法 HMCs 在RIPA 缓冲液中裂解，提取总蛋白。蛋白质定量后，以10 μg 蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF 膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h 后，加入一抗，4 ℃过夜孵育；洗膜10 min，3 次；加HRP 标记的二抗（1∶2 000），37 ℃孵育1 h；洗膜10 min，3 次。显影：用Image reader LAS-4000 程序显影拍摄。图像分析：Image pro plus 图像分析软件处理数据。

1.3.5 ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的表达

将提取的培养上清液按照试剂盒的说明书调节浓度，设立空白对照孔、阳性对照孔及样品检测孔，依次加入一抗、二抗，最后显色，观察到样本孔及标准品孔变蓝，每孔加入50 μL 终止液终止反应，在酶标仪450 nm波长处读各孔的吸光度值。

1.4 统计学方法

用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，GraphPad Prism 6.0作图。多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同IgA1 干预系膜细胞后培养上清液中炎症因子的表达

2.1.1 人炎症因子蛋白芯片的结果 如图1 所示：P-aIgA1组蛋白芯片中有多个蛋白显著高表达。

图1 蛋白芯片检测不同IgA1干预HMCs后培养上清液中炎症因子的表达Fig 1 Expression of inflammatory factor in cultured HMCs supernatant induced by different IgA1s

2.1.2 蛋白芯片结果统计分析 如图2所示，与对照组比较，P-aIgA1 组HMCs 培养上清液中白介素-6 可溶性受体（interleukin-6 soluble receptor，IL-6sR）、受激活调节的正常T 细胞表达和分泌因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）、金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、金属蛋白酶组织抑制因子2 （tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）、TNF-α 和肿瘤坏死因子Ⅱ型受体（tumor necrosis factor type Ⅱreceptor，TNFRⅡ）的表达水平均显著上调（均P<0.01），分别为对照组的34 倍、124 倍、269 倍、100 倍、1.6 倍以 及52 倍；N-aIgA1、P-IgA1、P-aIgA1 都 能 促 进TIMP2的表达，差异均有统计学意义（均P<0.01）。

图2 人炎症因子蛋白芯片的统计分析Fig 2 Statistical chart of the array

2.2 不同成分的IgA1对系膜细胞增殖的影响

分别用含N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 的培养基培养HMCs 24 h后（以同体积的PBS干预HMCs为对照组），用MTT法观察HMCs的增殖程度。结果（图3）显示：与对照组相比，N-IgA1 组对HMCs 的增殖无显著的影响，P-IgA1 及P-aIgA1 都能显著促进HMCs的增殖（P=0.045 和P=0.003）；与N-IgA1 组相比，P-aIgA1 组HMCs 出现了显著的增殖，差异有统计学意义（P=0.036）。

图3 不同的IgA1对系膜细胞增殖的影响Fig 3 Effects of different IgA1s on the proliferation of mesangial cell

2.3 不同浓度的P-aIgA1对系膜细胞增殖的影响

分别用含25、50、100 和250 μg/mL P-aIgA1 的培养基培养HMCs（以同体积的PBS 干预HMCs 为对照组），观察其对HMCs 增殖的影响。如图4 所示，25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明显地促进HMCs的增殖，50 μg/mL 和100 μg/mL 的浓度促进HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促进HMCs 的增殖程度最高。

图4 不同浓度的P-aIgA1对系膜细胞增殖的影响Fig 4 Effects of different concentrations of P-aIgA1 on the proliferation of mesangial cell

2.4 不同IgA1对HMCs中HDAC1蛋白的影响

采用Western blotting 方法检测了不同IgA1 对系膜细胞HDAC1 蛋白的影响，以同体积PBS 干预的HMCs 为对照组（图5）。结果显示：与对照组相比，P-aIgA1、P-IgA1 及N-IgA1 均不同程度地增加了HMCs 中HDAC1 的表达，分别是对照组的（8.64±0.59） 倍、（5.42±0.16） 倍 和（5.87±0.58） 倍；与N-IgA1 组相比，P-aIgA1 组显著增加了HDAC1 表达，差异有统计学意义（P=0.021）。

图5 不同IgA1对系膜细胞HDAC1蛋白的影响Fig 5 Effects of different IgA1s on HDAC1 protein in HMCs

2.5 VPA对系膜细胞增殖及分泌TNF-α蛋白的影响

2.5.1 VPA 对P-aIgA1 引起的系膜细胞增殖的抑制作用 以同体积的PBS 干预HMCs 为对照组，用50 μg/mL 的P-aIgA1 作用HMCs 前分别用50、100、200、400、1 000 μg/mL的VPA进行预处理1 h，观察其对HMCs 增殖的抑制作用（图6）。与对照组相比，50 μg/mL 的P-aIgA1 显著促进了HMCs 的增殖（P=0.009）。低浓度（50～200 μg/mL）的VPA 抑制HMCs增殖的作用不明显，400 μg/mL的VPA 出现了显著的抑制作用（P=0.028），1 000 μg/mL 的VPA 出现了过度抑制（P=0.002）。

图6 不同浓度的VPA对P-aIgA1作用的HMCs增殖的影响Fig 6 Effects of different concentrations of VPA on the proliferation of mesangial cell induced by P-aIgA1

2.5.2 VPA 对系膜细胞分泌TNF-α 蛋白的影响 分别用N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1 及P-aIgA1+VPA 作用HMCs 24 h 后（以同体积的PBS 干预HMCs 为对照组），用ELISA法观察HMCs细胞培养上清液中TNF-α蛋白表达（图7）。结果显示：与对照组相比，P-aIgA1 组TNF-α 蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P=0.001）；与P-aIgA1 组比较，P-aIgA1+VPA组TNF-α 蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（P=0.035），表明VPA 可以抑制P-aIgA1 诱导的HMCs细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达。

图7 不同干预成分对HMCs培养上清液TNF-α 蛋白表达水平的影响Fig 7 Effects of different stimulators on TNF-α protein in HMCs cultured supernatant

3 讨论

IgA肾病是全球活检报告中最常见的原发性肾小球肾炎［13］，好发于年轻人，在诊断后20年内，有30%～40%的患者发展为终末期肾病［14-15］。然而，目前临床上却没有有效的治疗手段能够阻止疾病的进展。

肾组织中系膜细胞增殖及局部的炎症是促进IgA肾病疾病进展的重要环节。本研究通过体外IgA 肾病模型探讨含有Gd-IgA1复合物沉积肾脏后引发的系膜细胞增殖及炎症反应。应用人炎症因子蛋白芯片观察不同成分的IgA1 对人系膜细胞分泌炎症因子表达的影响。结果显示：与对照组比较，P-aIgA1 组HMCs培养上清液中IL-6sR、RANTES、TIMP1、TIMP2、TNF-α 和TNFRⅡ的表达水平显著上调。上述结果表明P-aIgA1最能促进系膜细胞释放促炎症因子。

为了进一步研究不同成分的IgA1 对系膜细胞增殖的影响，我们分别用N-IgA1、P-IgA1和P-aIgA1作用于HMCs 24 h 后，用MTT 法观察HMCs 的增殖程度。结果显示：与对照组相比，N-IgA1 组对HMCs的增殖无显著的影响，P-aIgA1 及P-IgA1 组能够显著促进HMCs 增殖。接着我们分别用不同浓度的P-aIgA1 作用HMCs，观察其对HMCs 增殖的不同影响。结果显示：25 μg/mL 的P-aIgA1 就可以明显地促进HMCs 的增殖，50 和100 μg/mL 的浓度促进HMCs的增殖程度相似，250 μg/mL 促进HMCs 的增殖程度最高，显示了P-aIgA1 促进HMCs 增殖呈浓度依赖。上述研究结果表明P-aIgA1 能显著促进系膜细胞释放促炎症因子和系膜细胞增殖，但是其内在机制并不清楚。

组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学的重要作用机制之一，组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰在肾脏的发育和肾脏疾病的发生过程中起着多重作用［14，16-17］。我们前期研究［18］已发现：IgA肾病患者肾组织中HDAC1显著上调，H3Ac蛋白水平明显下调。为了进一步研究体外IgA肾病模型中组蛋白乙酰化情况，我们用不同成分的IgA1干预HMCs，观察其对系膜细胞中HDAC1蛋白的影响。结果显示：与对照组相比，N-IgA1、P-IgA1、P-aIgA1刺激HMCs后均不同程度地增加了HMCs的HDAC1表达；与N-IgA1 组相比，P-aIgA1 组更显著地增加了HDAC1蛋白。由此可见，HDAC1在P-aIgA1干预系膜细胞的过程中显著升高，参与了系膜细胞增殖和炎症反应。

HDACs 蛋白是细胞内最重要的蛋白之一，它能广泛地调节细胞的功能［19］。HDAC 抑制剂如VPA 的研究，正在成为一个有吸引力的领域。VPA抗细胞增殖、抗炎及抗纤维化作用也日益受到关注。研究发现，VPA可通过激活线粒体固有的凋亡途径诱导细胞凋亡［20］；可以抑制胶质母细胞瘤中神经胶质瘤干细胞的增殖和运动［21］。我们在前期研究中还发现：VPA 可以显著下调体外IgA 肾病模型中HDAC1 的表达，上调H3Ac 的表达，显著减轻细胞外基质的合成［12］。

本研究继续观察了不同浓度VPA 对HMCs 分泌TNF-α 及HMCs 增殖的影响。本研究应用P-aIgA1 显著促进HMCs 增殖，然后分别用不同浓度的VPA 进行干预，结果发现：400 μg/mL 出现了显著的抑制细胞增殖作用。同时还发现，VPA 也显著抑制了P-aIgA1 诱导的TNF-α 的表达。有研究表明，VPA 不仅可以抑制TNF-α 的表达，还可以抑制NF-κB 和IL-6等炎症信号通路［22］。

综上所述，P-aIgA1 能显著促进系膜细胞释放促炎症因子和系膜细胞增殖，且促细胞增殖作用呈浓度依赖。体外IgA 肾病细胞模型中存在乙酰化修饰异常，其参与了系膜细胞增殖和炎症反应。HDAC抑制剂VPA 可以部分逆转上述反应，提示其在疾病干预方面有一定应用前景，可为从表观遗传学角度防治IgA肾病提供新的思路。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究遵守《赫尔辛基宣言》的宗旨，并经上海交通大学医学院附属瑞金医院研究伦理委员会批准（No［2010］29）。研究对象或其亲属已经签署知情同意书。

This study was conducted in accordance with theDeclaration of Helsinki， and was reviewed and approved by the Ethics Committee of Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （No［2010］29）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献/Authors'Contributions

戴芹、王伟铭参与实验设计；戴芹参与论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by DAI Qin and WANG Weiming. The manuscript was drafted and revised by DAI Qin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-01

·Accepted：2022-06-03

·Published online：2022-06-28