黄芪多糖对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮炎的干预作用及其机制*

陈若玺， 郑 胜， 郭春燕， 张 强

(福建医科大学附属龙岩第一医院皮肤科， 龙岩 364000)

银屑病是一种炎性表皮过度增生性皮肤病，影响全球约2%～3%的人口，复发率高[1]。临床上，其特征是表皮角质细胞增生、角化不全和大量白细胞的皮肤浸润，表现为皮肤表面有红斑和鳞状斑块[2]。大量研究表明，细胞因子在银屑病进程中具有重要作用，白细胞介素(IL)-17、IL-22、IL-23和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平升高，诱导皮肤角质形成细胞的过度增殖[3, 4]。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)，属咪唑喹啉类化合物，是一种小分子免疫调节剂。咪喹莫特可作为Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)激动剂激活宿主的免疫反应，引起免疫调节相关细胞因子的转录，被发现可以通过IL-23/IL-17炎性反映轴、IL-27诱导自然杀伤细胞分泌Ⅱ型干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α、氧化应激诱导粘附分子、趋化因子等多条途径参与银屑病样皮炎的发生过程[5, 6]。由于其致病过程较为直接，发病速度快，故目前也有利用咪喹莫特造模小鼠银屑病样皮炎模型的实验应用。

近年来的研究发现黄芪中含多糖、皂甙、黄酮、氨基酸等多种有效成分，这些活性成分均有促进抗体生成和免疫反应的作用，其中以对黄芪多糖(astragalus polysacharin，AP)的研究报道为多[7-9]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，已有研究表明，黄芪多糖具有调节炎症和免疫功能的作用，本文旨在探讨黄芪多糖对咪喹莫特诱导银屑病样皮炎的干预作用及其机制，为黄芪多糖在临床上用于治疗银屑病样皮炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康C57BL/6小鼠40只，雌性，6～8周龄，由南京大学模型动物研究中心提供。将小鼠饲养在屏障环境中，小鼠在保持12 h的明暗循环，给予正常小鼠饲料与灭菌水适应性喂养一周。

1.2 主要试剂及仪器

黄芪多糖(批号：20170916，合肥中龙神力动物药业有限公司)；丽科杰咪喹莫特乳膏(湖北科益药业股份有限公司，货号：120710)；医用白凡士林(南京特纳斯生物技术开发有限公司，货号：20180130)；小鼠TNF-α(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-M0049c)ELISA检测试剂盒；小鼠IL-1β(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-M0037c)ELISA检测试剂盒；小鼠IL-6(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-M0044c)ELISA检测试剂盒。

微型高速离心机(美国Labnet，型号C2500-R-230V)，电热恒温培养箱(日本ASONE，型号ICV-450)，全自动酶标仪(美国Thermo Scientific，型号Multiskan MK3)，全自动全封闭组织脱水机(型号：Leica ASP200S)；石蜡包埋机(型号：Leica EG1150H)；半自动轮转式切片机(型号：Leica RM2245)；全自动染色机(型号：Leica Autostainer XL)；全自动玻片封片机(型号：Leica CV5030)。

1.3 小鼠银屑病模型的建立及分组设计

40只雌性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型组、黄芪多糖高剂量组(200 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)和低剂量组(50 mg/kg)，共5组，每组8只。从小鼠背上刮去2 cm×2 cm面积的皮毛，除空白对照组外，用玻璃棒将5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各组小鼠背部，涂抹剂量为62.5 mg，1次/日，连续6 d。在建模的同时对各组实验小鼠进行分别给药，给药的方式为灌胃。空白对照组、模型组小鼠灌胃等体积的0.9%生理盐水；黄芪多糖高、中、低剂量组分别给予黄芪多糖(200 mg/kg)、黄芪多糖(100 mg/kg)、黄芪多糖(50 mg/kg)。给药的容积均为 10 ml/kg 体质量，1次/日，连续给药6 d。于实验第7日，小鼠麻醉后剪取背部皮肤，摘眼球取血，分离血清，置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 小鼠皮损 PASI 评分

小鼠银屑病模型评分标准根据临床银屑病面积和严重程度指数(PASI)进行客观评分系统。将红疹分为0 - 4级，0为无；1为轻微；2为中等；3为严重；4为非常严重[10]。每天记录体重和得分。

1.5 ELISA检测

用ELISA试剂盒检测血清样品中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。具体方法严格按照试剂盒操作说明。

1.6 实时定量PCR实验

每组样品加入1 ml Trizol，待细胞充分裂解，每组加入250 μl氯仿，常温静置5 min 后离心20 min。离心结束后，每组样品加入相同体积的异丙醇，常温静置 5 min后离心30 min。离心结束后，除去上清，用75 %乙醇洗涤沉淀2次，常温通风处晾干，即得到RNA样品。按照反转录试剂盒说明书，反转录得到cDNA。根据说明书配置PCR反应体系，使用荧光定量PCR仪进行Real-Time PCR，反应程序为：预变性，50℃ 2 min；解链，95℃ 10 min；PCR反应，95℃ 15 s，45个循环；60℃ 1 min。收集荧光实时定量 PCR数据，并分析结果。引物序列如下：TNF-α forward: 5’-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3’；TNF-α reverse: 5’-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3’；IL-1β forward: 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’；IL-1β reverse: 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；IL-6 forward: 5’-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3’；IL-6 reverse: 5’-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3’；β-actin forward: 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；β-actin reverse: 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.7 流式细胞术

分离小鼠腋窝淋巴结，制备单细胞悬液。使用FACS缓冲液中的表面抗原抗体进行表面染色，然后用适当的抗体在冰上染色30 min。使用活性染料消除死亡细胞。细胞内细胞因子染色用细胞固定液/细胞外膜液，固定细胞并渗透，加入FITC标记的CD11b抗体进行染色。利用BD公司FACS Calibur流式细胞仪检测CD11b阳性细胞比例。

1.8 Western blot

用PBS漂洗细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解，离心10 000 r/min，20 min，提取蛋白质。用BCA法测定蛋白质浓度，用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。采用的是半干法转移蛋白到硝酸纤维素膜。用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭。后用PBS洗去BSA，一抗用PBST稀释至工作液浓度，4℃孵育过夜。24 h后，用PBST清洗3次，每次5 min。用PBST稀释二抗至工作液浓度，避光37℃恒温摇床反应1 h。后用PBST清洗。用ImageJ Setup软件扫描蛋白条带的灰度值。检测GSDMD和Caspase-11蛋白水平，内参蛋白为β-actin，以目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白灰度值之比表示蛋白表达的相对水平。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 黄芪多糖对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮肤炎症的影响

与对照组相比，模型组小鼠皮肤表现为出鳞屑及红斑，皮肤组织皮质显著增厚(P<0.01)，PASI 评分显著增加(P<0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠银屑病样皮损症状及皮肤组织皮质增厚显著减轻，且呈浓度依赖性(P<0.05，表1)， PASI 评分显著减少，且呈浓度依赖性(P<0.01，表1)。与对照组相比，实验第6日模型组小鼠体重显著降低(P<0.01)，黄芪多糖高、中剂量组小鼠的体重下降被缓解(P<0.05，表2)。此外，与对照组相比，模型组小鼠脾脏重量显著增加(P<0.01)，而与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠的脾脏重量显著减少(P<0.05，表2)。以上结果表明，黄芪多糖能显著改善咪喹莫特诱导银屑病样皮炎的症状。

Tab. 1 The epidermal thickness and clinical score of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

Tab. 2 The body weight and spleen weight of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

2.2 黄芪多糖对咪喹莫特诱导小鼠炎症因子表达的影响

ELISA检测结果表明，与对照组相比，模型组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌显著增加(P<0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌减少，且高剂量组效果最显著(P<0.05，表3)。实时定量PCR检测结果表明，与对照组相比，模型组小鼠皮肤组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达显著增加(P<0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠皮肤组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达显著减少，且高剂量组效果最显著(P<0.05，表4)。上述结果表明，黄芪多糖可改善咪喹莫特诱导的小鼠炎症因子的表达。

Tab. 3 The serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice(pg/ml, n=5)

Tab. 4 The mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.3 黄芪多糖对咪喹莫特诱导小鼠巨噬细胞浸润的影响

利用流式细胞术研究黄芪多糖对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中免疫细胞浸润的影响。实验结果显示，对照组小鼠CD11b+巨噬细胞比例为 3.51%±0.53%，模型组小鼠CD11b+巨噬细胞比例为22.29%±2.84%，黄芪多糖高剂量组小鼠CD11b+巨噬细胞比例为12.40%±1.56%。与对照组相比，模型组小鼠CD11b+巨噬细胞在淋巴结的浸润显著增加(P<0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高剂量组小鼠CD11b+巨噬细胞在淋巴结的浸润显著减少(P<0.05)。进一步检测皮肤组织中与巨噬细胞相关的趋化因子mRNA表达水平的结果表明，与对照组相比，模型组小鼠皮肤组织中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高剂量组小鼠皮肤组织中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA水平显著减少(P<0.05，表5)。

Fig. 1 The CD11b+ cell infiltration in lymph nodes of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 5 The mRNA levels of Ccl2, Cx3cl1 and Cxcl10 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.4 黄芪多糖对巨噬细胞焦亡的影响

检测细胞焦亡相关蛋白表达的结果表明，与对照组相比，模型组小鼠巨噬细胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表达显著升高(P<0.01)，GSDMD和Pro-caspase-11蛋白的表达没有显著差异(P>0.05)。与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠巨噬细胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表达显著降低，且高剂量组效果最显著(P< 0.05，表6)。进一步检测血清中LDH的结果表明，对照组小鼠血清中LDH水平为(1488.33±274.75)U/L，模型组小鼠血清中LDH水平为(7024.00±336.35)U/L，黄芪多糖高、中、低剂量组小鼠血清中LDH水平为(3042.41±453.64)U/L、(5207.29±451.25)U/L、(6015.31±771.26)U/L。与对照组相比，模型组小鼠血清中LDH的释放显著增加(P< 0.01)。与模型组相比，黄芪多糖高、中剂量组小鼠血清中LDH的释放减少(P<0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 6 The protein levels of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

3 讨论

银屑病样皮炎是一种常见的、慢性、炎症性皮肤病，以皮肤红斑、丘疹、鳞屑为主要特征，目前临床尚无有效的治疗方法[11]。组织病理学特点是，银屑病样皮炎组织中存在大量炎症细胞[12]，具体为角质形成细胞的过度增殖和分化异常、表皮大量中性粒细胞浸润和真皮浅层血管周围被以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润[13]。目前，许多研究发现，银屑病与炎症密切相关[14]。据报道，经典的促炎细胞因子 TNF-α在银屑病样皮肤炎症中发挥关键作用，导致体内强烈炎症的诱导炎性因子如 iNOS、COX-2、IL-6和 IL-1β的释放[15]。因此，抗炎治疗能缓解银屑病样皮肤炎症。

据报道，巨噬细胞在银屑病样皮肤炎症中发挥重要作用[16]。巨噬细胞主要由TLR 7、8 和 9表达，咪喹莫特的主要生物学效应是通过对TLR 7和8的激动介导的[17]。银屑病是一种细胞因子和趋化因子驱动的疾病，其病变是由于免疫细胞浸润和角质形成细胞过度增殖所致[18]。巨噬细胞通过激活TLR可以诱导多种炎性因子的产生[19]。除此之外，细胞焦亡也是巨噬细胞释放促炎细胞因子的重要因素。细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡。在微生物感染时会导致巨噬细胞Caspase-11的激活，进而引发GSDMD被切割，形成的N端GSDMD寡聚化在细胞膜上形成孔道，最终造成细胞焦亡[20]。细胞焦亡的发生导致细胞膜破裂，引起细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应。鉴于巨噬细胞活化和细胞焦亡在促炎因子释放过程中发挥的重要作用，抑制巨噬细胞在皮肤组织中的浸润和活化是治疗银屑病的可行策略。

有关黄芪多糖具有调节炎症和免疫作用的研究已有多方面报道[21]，但目前就黄芪多糖对银屑病样皮炎的作用尚未有报道。本研究结果表明，黄芪多糖可以改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病，且高剂量组效果最明显。已有研究证实，TNF-α、IL-1β和IL-6信号传导在银屑病发病过程中发挥重要作用[22]，黄芪多糖治疗可明显抑制血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌以及皮损组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 表达。在银屑病中，巨噬细胞的浸润是该疾病进展的关键因素。而黄芪多糖减少皮损组织中巨噬细胞的浸润，并降低Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表达。细胞焦亡对于巨噬细胞活化至关重要。本研究结果提示，黄芪多糖能抑制Caspase-11和GSDMD的活化并降低LDH的释放，说明黄芪多糖能抑制巨噬细胞焦亡。综合以上研究结果表明，黄芪多糖能通过抑制巨噬细胞焦亡减少促炎因子释放，改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症。