lncRNAs在胶质母细胞瘤中的研究进展

林伟力，尹文敏，王梓良，陈胜利

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，其中胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是中枢神经系统最具侵袭性和致命性的原发性恶性肿瘤。新诊断的GBM患者平均总生存时间仍<14.6个月，复发的GBM患者平均总生存时间则为6.9个月[1]。为了探讨GBM的本质，目前通过大规模基因测序分析手段，对包括非编码基因组在内的表观遗传学机制的研究越来越深入。其中长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)基于其组织特异性，正被开发为新的诊断和治疗靶点。

1 lncRNAs的概述

lncRNAs是真核生物基因组的转录产物，长度超过200个核苷酸，没有或只有有限的蛋白质编码能力，因其组织特异性和在肿瘤中异常表达的特点而得到广泛研究。lncRNAs存在于细胞核或细胞质中，根据其亚细胞定位发挥不同的功能。在细胞核中，lncRNAs可能参与基因表达和mRNA剪接的转录调控；而在细胞质中，它们可以影响基因的稳定性和调节蛋白质的功能[2]。在过去的十年里，越来越多的证据表明，lncRNAs参与了许多肿瘤病理生理过程，如调控细胞周期、细胞凋亡、自噬、侵袭和迁移等[3]。在包括GBM在内的许多人类癌症中已经观察到lncRNAs表达的失调，并且通过其作为抑癌基因或癌基因的作用与癌症的分期和分级密切相关，也可作为有潜力的治疗靶点。此外，lncRNAs可以用作新的生物标志物，在GBM的诊断、分级分期及判断预后中具有良好的临床应用前景。

2 lncRNAs在GBM发病机制中的双重作用

已报道多种lncRNAs在GBM组织和细胞系中，与正常组织相比表达显著上调，促进GBM细胞的生长、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，从而发挥着致癌的作用，比如XIST[4]、SNHG5[5]、FOXD2-AS1[6]、UCA1[7]、LINC01446[8]等。也有一些lncRNAs在GBM组织和细胞系中，与正常组织相比表达显著上调，促进了细胞凋亡，降低了GBM细胞的存活率，同时阻碍了GBM细胞的迁移和侵袭，比如TCONS_00020456[9]、UBE2R2-AS1[10]、LINC-PINT[11]、MATN1-AS1[12]、AC016405.3[13]。现将研究作用机制较为明确的lncRNAs进行汇总，见表1、表2。

表1 GBM中发挥促癌作用的lncRNAs

表2 GBM中发挥抑癌作用的lncRNAs

3 lncRNAs在胶质母细胞侵袭和迁移过程的作用

3.1 调控细胞周期

3.1.1 FOXD2-AS1/miR-31/CDK1级联信号通路 lncRNA FOXD2-AS1在GBM组织中表达上调，而且FOXD2-AS1高表达的胶质瘤患者预后较差。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)是细胞周期进程中的关键介质，其中CDK1与G1或G2细胞周期蛋白复合，控制细胞周期。Wang等[6]通过双荧光素酶报告实验证实，FOXD2-AS1通过海绵包裹miR-31上调了CDK1的表达。FOXD2-AS1的沉默通过释放miR-31而下调CDK1，从而诱导GBM细胞的G1期阻滞，阻滞了细胞周期，抑制了GBM细胞的增殖。补救实验证实了GBM中的FOXD2-AS1/miR-31/CDK1调控环。

3.1.2 LINC01446/miR-489-3p/TPT1级联信号通路 lncRNA LINC01446，它在GBM组织中表达上调。Zhang等[8]分析了无偏微阵列数据库中所有lncRNAs的表达，发现在GBM组织中高表达的lncRNAs中，LINC01446是其中表达最多的，这表明LINC01446可能在GBM进展中起作用。功能研究证明，LINC01446基因缺陷可抑制体外和体内GBM细胞增殖，导致停滞在细胞周期G1期的细胞增多，阻滞了细胞周期进程。另外，Yang等[19]发现，lncRNA DGCR5在GBM中表达下调。转染DGCR5可明显抑制U87和U251细胞的存活率和集落形成能力，而DGCR5过表达会导致GBM细胞周期停滞，增加细胞凋亡，从而削弱了GBM细胞的迁移、侵袭和逆转上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)的过程。

3.2 调控细胞凋亡

3.2.1 UCA1/miR-193a/CDK6级联信号通路 Xin等[7]发现，在GBM细胞(U-118 MG和A172)中，lncRNA-UCA1基因敲除降低了细胞活力，促进了U-118 MG和A172细胞凋亡，并抑制了细胞的迁移和侵袭行为。其中lncRNA-UCA1基因敲除通过miR-193a介导的CDK6沉默，阻断了PI3K/AKT、MAPK和Notch信号通路，促进细胞凋亡，降低了GBM细胞的存活率。

3.2.2 WEE2-AS1/miR-520F-3p/SP1级联信号通路 Lin等[14]发现，WEE2-AS1在GBM组织和细胞系中的表达明显增强。WEE2-AS1可作为microRNA-520F-3p(miR-520F-3p)的“分子海绵”，增加GBM细胞中特异性蛋白1(specific protein 1，SP1)的表达，从而抑制GBM细胞凋亡。WEE2-AS1在体外减弱了GBM细胞的增殖、迁移和侵袭，促进了细胞凋亡，并损害了体内肿瘤的生长。一系列补救实验表明，抑制miR-520F-3p和上调SP1可部分消除WEE2-AS1下调对GBM细胞的影响。WEE2-AS1可以吸附miR-520F-3p，增加内源性SP1的表达，从而抑制GBM细胞凋亡，促进GBM的恶性转化。

3.3 调控GBM干细胞 一些胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)是高度致瘤性的细胞亚群，有助于GBM复发和治疗耐药。Xia等[20]发现，lncRNA HOTAIRM1在GSCs中显著升高。HOTAIRM1邻近基因HOXA1、HOXA2和HOXA3在胶质瘤中也显著上调，并与HOTAIRM1的表达相关。其中，HOXA2和HOXA3在GSCs中表达上调，并参与这些GBM干细胞的自我更新。HOTAIRM1的沉默显著损害了GSCs的增殖、凋亡、自我更新和肿瘤发生。综上所述，表明HOTAIRM1在GSC的自我更新中起着关键作用。

SRC-1/lncRNA XIST/miR-152/KLF4途径，GBM复发归因于GBM干细胞的存在。Gong等[21]发现，类固醇受体辅活化子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)的表达与胶质瘤的分级呈正相关，与胶质瘤患者的预后呈负相关，SRC-1促进GBM细胞的增殖、迁移和肿瘤生长。其中，SRC-1基因敲除抑制了GBM细胞的干性。SRC-1可通过lncRNA XIST/microRNA(MiR)-152轴促进Kruppel样因子4(Kruppel like factor 4，KLF4)的表达，从而介导SRC-1促进GBM干性特性的功能。

3.4 调控细胞自噬 Liu等[22]证实，LINC00470是GBM中AKT激活的正调控因子，其中AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为蛋白激酶B，在增殖、自噬、代谢和生存等多种细胞过程中发挥重要作用。LINC00470与FUS和AKT结合形成三元复合物，将FUS锚定在细胞质中，提高AKT活性。LINC00470激活的高pAKT抑制了影响糖酵解的HK1泛素化，并抑制了细胞的自噬,从而导致GBM的发展。lncRNA LINC00470作为新的AKT激活剂调控GBM细胞自噬。

3.5 EMT Wu等[23]发现，MIR155HG增高与胶质瘤分级、间质转化及预后不良有关，他们采用逆转录定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测MIR155HG的表达情况。与正常脑组织中的水平相比，这些GBM样品中MIR155HG的水平显著上调(P<0.000 1)。选择了3个间质转化相关标记物(POSTN、MMP1 1和FN1)，发现高MIR155HG表达的GBMs(n=5)的表达水平高于低MIR155HG表达的GBMs(n=5)。接下来，为了直接测试MIR155HG在间质转化中的功能作用，MIR155HG在胶质瘤细胞中被特异性siRNA下调。MIR155HG的降低引起β-连环蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶9的显著降低。这些结果有力地证明了，MIR155HG是一种间质转化相关的lncRNA。

Yang等[19]发现，lncRNA DGCR5在GBM中表达下调，转染DGCR5可明显抑制U87和U251细胞的存活率和集落形成能力。此外，DGCR5过表达导致细胞周期停滞，增加细胞凋亡，削弱了GBM细胞的迁移、侵袭和EMT的过程。lncRNA DGCR5抑制GBM细胞的增殖、侵袭性表型和EMT。

Zhu等[11]采用RT-qPCR方法，检测LINC-PINT在GBM细胞系中的表达下调。通过肿瘤移植实验和肿瘤腹膜转移实验验证了LINC-PINT抑制GBM的细胞进展、侵袭和EMT。通过Western Blot和免疫荧光染色及补救实验检测出 LINC-PINT位于Wnt/β-连环蛋白通路的上游，通过阻断GBM中的Wnt/β-连环蛋白信号来抑制肿瘤的增殖、侵袭和EMT。

4 lncRNAs作为GBM标志物的应用

越来越多的研究证明，lncRNAs在包括GBM在内的各种癌症的发生和发展中的关键作用。lncRNAs被分泌到循环中，一部分自由循环，一部分被选择性地包装成外泌体，这表明这些分子可以用作新的生物标志物，在GBM的诊断、分级分期及判断预后中，具有良好的临床应用前景。

4.1 诊断的生物标志物 Gao等[24]通过研究发现，与邻近正常脑组织相比，GBM组织中FLVCR1-AS1的表达显著上调，且GBM细胞系中FLVCR1-AS1的表达高于正常人脑星形胶质细胞。FLVCR1-AS1基因敲除，抑制了GBM细胞的增殖和侵袭能力，所以，FLVCR1-AS1可作为GBM的一种新诊断生物标志物。

通过对6对GBM样本和邻近正常组织进行微阵列检测，Xu等[10]发现了一个新的lncRNA，UBE2R2-AS1，它在GBM中与正常组织相比显著下调。体外实验证明，lncRNA UBE2R2-AS1通过直接靶向miR-877-3p/TLR4抑制GBM细胞的生长、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。这些关于UBE2R2-AS1及其胶质瘤相关分子机制的信息，将有助于未来识别新的以lncRNA为导向的GBM诊断和药物靶向治疗。

lncRNA HOX转录反义间质RNA(HOTAIR)在GBM中调节失调，是GBM细胞增殖所必需的[25]，从而推测HOTAIR的表达可能作为GBM的外周生物标志物。通过检测了GBM患者血清中的HOTAIR发现GBM患者血清HOTAIR水平显著高于相应对照组(P<0.000 1)，受试者工作特征曲线下面积为0.913(95%CI：0.845～0.982，P<0.000 1)，其敏感度为86.1%，特异度为87.5%。HOTAIR表达与高级别脑肿瘤显著相关。此外，Pearson相关分析显示，血清HOTAIR水平与相应的肿瘤HOTAIR水平呈中度相关(r=0.734，P<0.01)。结果表明血清HOTAIR可以作为GBM的一种新的预后和诊断生物标志物。

4.2 指导临床病理分期 与正常样本相比，ASB16-AS1在TCGA数据库中显示肿瘤显著增加，并且对诊断胶质瘤具有高敏感性和特异性。Zhang等[26]利用RT-qPCR检测人脑胶质瘤组织中ASB16-AS1的表达,结果表明77例胶质瘤组织中，ASB16-AS1的表达明显高于15例正常组织。在低级别胶质瘤(WHO Ⅰ级和Ⅱ级)与高级别胶质瘤(WHO Ⅲ级和Ⅳ级)中，ASB16-AS1的表达与世界卫生组织等级显著相关。这表明lncRNA ASB16-AS1在组织标本中的表达存在明显差异，并与肿瘤的分期和分级密切相关。

通过分析基因表达谱交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库，Yao等[16]发现，与正常组织相比，PCED1B-AS1在GBM中是上调最显著的lncRNA。评估了PCED1B-AS1表达与GBM患者临床病理特征之间的关系发现，高PCED1B-AS1与较大的肿瘤体积和较高的胶质瘤分级呈正相关。更重要的是，高PCED1B-AS1的患者比低PCED1B-AS1的患者显示出更短的存活时间。这表明PCED1B-AS1在GBM组织和细胞系中显著上调，且与胶质瘤分级分期密切相关。

为了检测人类GBM中MIR155HG的表达，Wu等[23]分析了CGGA数据集中5个正常和220个GBM组织的全基因组基因谱。GBM组织与正常组织相比，MIR155HG转录水平显著增加(P=0.005 1)。此外，高分级胶质瘤(high grade glioma，HGG)中MIR155HG的表达显著高于低分级胶质瘤(low grade glioma，LGG)(Ⅳ级vsⅡ级，P<0.001；Ⅲ级vsⅡ级，P=0.021 6)。而后在另一个独立的胶质瘤基因表达数据集伦勃朗(REMBRANDT)中研究发现，MIR155HG表达水平与胶质瘤分级显著相关(单向P<0.000 1)，这与CGGA数据一致。综上表明，lncRNA MIR155HG增高与胶质瘤分级密切相关。

4.3 预测患者预后 通过研究来自基因表达总集和分子脑肿瘤资料库的公开可用胶质瘤微阵列数据集中的lncRNA表达谱，Li等[27]在1 080例GBM样本的训练集中，经单因素Cox回归分析，P<0.005，发现胰岛素样生长因子结合蛋白7-反义1(insulin-like growth factor binding protein 7-antisense 1，IGFBP7-AS1)等4个lncRNA与患者总生存期有显著相关(P<0.05)，其中IGFBP7-AS1与患者总生存期显著相关(P<0.05)。体外实验表明，IGFBP7-AS1基因的敲除抑制了U87和U251胶质瘤细胞的存活、迁移和侵袭。从而，确定了IGFBP7-AS1基因是一个能够预测GBM预后的lncRNA信号。

Fawzy等[28]检测了GBM患者脑肿瘤组织中microRNA miR-326和lncRNA H19(通过计算机分析发现miR-326可能的结合位点)的表达水平，并与非癌症脑组织进行了比较。在GBM患者中，miR-326的相对表达水平没有发现明显改变。相比之下，H19在所有GBM患者中持续过表达(<0.001)，并与较差的总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression free survival，PFS)相关(分别为P=0.026和P=0.045)。H19上调可预测GBM患者的OS，其敏感性为71.4%，特异性为59.6%(P=0.026)。H19在GBM的发病机制中起作用，并可能成为GBM一个潜在的预后生物标志物。

Omer等[29]通过基因测序分析了75例原发性GBM患者的IDH1/2突变状态，用RT-qPCR检测了75例原发性GBM组织和5例正常脑组织中MALAT1的表达，确定了MALAT1表达、IDH1/2突变状态和患者临床病理变量之间的关系。在75例原发性GBM标本中有5例观察到IDH1(R132H)突变，而75例中均未检测到IDH2(R172H)突变。与正常脑组织相比，MALAT1在原发性GBM中的表达显著上调(P=0.025)。IDH1/2野生型原发性GBM中，MALAT1表达增加与患者年龄和肿瘤定位相关(分别为P=0.032和P=0.025)。多变量分析表明，高MALAT1表达是IDH1/2野生型原发性GBM总生存率的不利预后因素(P=0.034)。MALAT1高表达可能在原发性GBM中具有独立于IDH突变的预后作用。

5 lncRNAs在GBM治疗过程中的意义

5.1 介导化疗增敏 有研究[30]使用U87 GBM的全基因组表达分析，来鉴定NF-κB依赖因子(NF-κB是对DNA损伤的细胞毒性反应的重要调节因子)在替莫唑胺(temozolomide，TMZ)作用下的变化，发现lncRNA MALAT1是最显著上调的因子之一。减少MALAT1致敏患者来源的GBM细胞对TMZ的细胞毒性作用，以及体内纳米包裹的抗MALAT1 siRNA的体内递送，提高了TMZ在携带GBM异种移植物小鼠中的功效。这些发现支持MALAT1作为GBM化学增敏的靶点。

lncRNA MEG3在许多癌症中起着重要作用。为探讨MEG3的作用，Ma等[31]采用RT-qPCR检测顺铂作用下MEG3 mRNA的表达，结果表明，人U87细胞的顺铂治疗诱导了MEG3的表达，且呈时间和剂量依赖性。使用siRNAs沉默MEG3表达抑制顺铂诱导的U87细胞凋亡。相反，外源性MEG3表达增强了顺铂诱导的细胞凋亡。减少MEG3诱导的U87细胞自噬，提高U87细胞对顺铂的化疗敏感性。因此，lncRNA MEG3可能被认为是对抗顺铂耐药GBM的一个新的治疗靶点。

5.2 介导TMZ耐药

5.2.1 lncRNA BC200/miR-218-5p轴 TMZ抵抗是胶质瘤患者治疗失败的关键原因之一。TMZ抗性的分子机制尚不清楚。因此，Su等[32]使用暴露于TMZ处理的GBM细胞系来分析TMZ抗性现象中BC200/miR-218-5p轴之间的MGMT和MMR系统的相关性。BC200 RNA在体外和体内都高度表达，并通过调节肿瘤抑制因子miR-218-5p的表达，同时增强GBM细胞的自我更新和多能性，从而显著调节GBM的致癌性并增强TMZ化学抗性。

5.2.2 lncRNA HOTAIR/miR-519a-3p/RRM1轴 Yuan等[33]采用RT-qPCR检测HOTAIR、microRNA(MiR)-519a-3p和RRM1的表达水平。建立异种移植瘤模型发现在TMZ耐药的GBM细胞中，lncRNA HOTAIR显著上调，其下调抑制了耐TMZ的GBM细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。miR-519a-3p被证实是lncRNA HOTAIR的靶标，并且在TMZ抗性GBM细胞和用来自TMZ抗性GBM细胞的外泌体处理的GBM细胞中被lncRNA HOTAIR负调节。此外，他们还发现miR-519a-3p在TMZ耐药的GBM细胞中显著下调。深入分析表明，miR-519a-3p缺失减轻了lncRNA HOTAIR沉默介导的对TMZ抗性、增殖、迁移、侵袭和经提取自TMZ抗性GBM细胞的外来体处理的GBM细胞的EMT抑制作用。也就是说，外泌体介导的lncRNA HOTAIR转移，通过在体外海绵化miR-519a-3p来调节TMZ抗性。外泌体lncRNA HOTAIR通过miR-519a-3p/RRM1轴介导GBM的TMZ抗性。

5.2.3 lncRNA AC003092.1/miR-195/TFPI-2轴 Xu等[34]发现在GBM细胞(U87TR和U251TR)的TMZ抗性中，lncRNA AC003092.1的表达明显低于其亲本细胞(U87和U251)。在胶质瘤患者中，低水平的lncRNA AC003092.1与TMZ耐药性增加、复发风险高和预后不良相关。过表达的lncRNA AC003092.1增强了TMZ的敏感性，促进了细胞凋亡，并抑制了TMZ抗性GBM细胞的增殖。此外，还在体内外证实了lncRNA AC003092.1通过TFPI-2介导的细胞凋亡来调节TMZ的化疗敏感性。进一步的机制研究发现，lncRNA AC003092.1通过miR-195调节TFPI-2在GBM中的表达。综上所述，这些结果表明，lncRNA AC003092.1可以作为内源性CERNA抑制miR-195的功能，导致TFPI-2表达增加，从而促进TMZ诱导的细胞凋亡，从而使GBM细胞对TMZ更加敏感。本研究推测，过表达lncRNA AC003092.1可能是克服GBM患者对TMZ耐药性的一种潜在的治疗方法。

5.3 介导放疗增敏 临床上，GBM的特点是对放射治疗有抵抗力。抗辐射的一个主要机制是通过激活响应脱氧核糖核酸双链断裂(double-strand breaks，DSBs)DNA修复途径。共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ataxia telangiectasia-mutated kinase,ATM)是DNA修复反应的主要调节因子，而RAD51和BMI1都是参与DSBs重组的ATM下游DNA修复蛋白。RAD51在恶性胶质瘤中过度表达并导致抗辐射，BMI1在GBM细胞中富集，是DNA损伤反应机制的一个组成部分。RAD51的抑制已被证明对胶质瘤干细胞具有放射敏感性，GBM细胞中BMI1的缺乏严重损害了DNA DSB反应，导致对放射的敏感性增加。Li等[35]发现，HMMR反义lncRNA HMMR-AS1在GBM细胞中高表达并稳定HMMR mRNA。HMMR-AS1基因的敲除降低了HMMR的表达，抑制了细胞的迁移、侵袭和间质表型，并抑制了GBM细胞在体外和体内的生长。此外，HMMR-AS1的敲除通过减少DNA修复蛋白ATM、RAD51和BMI1的水平，使GBM在体外和体内对X光辐射敏感，增加GBM的辐射敏感性。

6 总结与展望

GBM是最常见的恶性颅内肿瘤之一，预后差。这种致命疾病的发病机制尚不完全清楚，可能涉及数千个基因、信号和分子成分。大量研究表明，lncRNAs被选择性地包装、分泌和转移到参与肿瘤微环境中细胞间通信的细胞之间，并可以调节GBM的许多特征，如增殖、自噬、凋亡、侵袭和细胞干性。研究还发现，lncRNAs被分泌到循环中，一部分自由循环，一部分被选择性地包装成外泌体，这为临床应用，包括诊断、疗效评价和判断预后提供了很大的希望。目前的基础研究及实验资料表明了它巨大的潜力，虽然前景看好，但要将lncRNAs用于临床治疗，仍有很多限制。首先，最主要的是安全性问题，如何保证lncRNA在复杂的调控网络下不会产生意想不到的副作用。lncRNAs的潜在致癌特征已在文献中报道，同一种lncRNAs在不同的肿瘤发生发展过程中可以起到完全相左的作用。其次，一大挑战是如何将各自的分子特异性地输送到靶细胞中，lncRNAs不是简单的单链结构，也有二级甚至三级结构，这可能导致无法有效干预。第三，与蛋白质编码基因不同，lncRNAs在不同物种间保守性差；因此，通过体外实验和动物模型开发的有效疗法可能难以用于人类。在肿瘤治疗中，对lncRNAs的研究仍集中在分子细胞学和小鼠肿瘤模型水平。到目前为止，还没有lncRNAs单独或与其他药物联合用于癌症治疗的临床试验。但是，在针对于GBM治疗过程中出现的TMZ耐药情况，以及在放化疗过程中增敏，lncRNAs无疑为科研提供了全新的思路。这一领域的新发现正在以更快的速度出现，相信在不久的将来，lncRNAs将会成为GBM诊断、治疗的重要手段之一。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。