奶粉中维生素K2检测方法的研究

赵彦远，温敏辉，黄正华

（广州金至检测技术有限公司，广东广州 510330）

0 引 言

目前第三方检测机构检测奶粉中的维生素K含量，主要参考《国家卫生健康委员会公告〔2016年第8 号〕》附录3（三）。该方法利用异丙醇直接对试样进行超声提取30 min，过0.45 μm 滤膜后，定容并上高效液相色谱仪测试，利用反相色谱分离法测定试样中维生素K的含量。邓梦雅等人针对食品中维生素K（MK_4、MK_7）的检测，采用柱后衍生反应使非荧光化合物维生素K产生荧光，并结合荧光检测器进行检测，从而建立了食物中维生素K（MK-4、MK-7）高效、准确、快速、灵敏的同时分离检测技术。刘光兰等人针对钙维生素D 维生素K 软胶囊内容物中维生素D和维生素K的含量测定方法，采用高效液相色谱法能同时快速检测试样中的维生素D和维生素K，不会因为其他杂质干扰目标物质等因素而影响检测。采用95%甲醇水溶液：异丙醇=（98：2 V：V），梯度洗脱，53 min 就能把样品中维生素D、维生素K流出，流动相的比例也能让维生素D、维生素K2 不受其他杂质峰的影响，达到准确的分离和定量。刘强等人采用正向高效液相色谱法测定软胶囊中维生素K（35）的含量。张艳海等人采用在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D和E 含量，取得了比较理想的结果。但是在实际应用中发现，利用这些方法对复杂样品基质中维生素K进行测定时并不完全适用，因为奶粉中含有大量的脂肪和蛋白质，特别是目标物含量低且干扰因素多的奶粉试样，存在着提取效率低、定性困难、定量不准、干扰大、分析时间长等问题。

为了解决目前方法存在的不足，本文通过采用特定的样品前处理步骤，即通过加入脂肪酶和蛋白酶有效避免奶粉中脂肪和蛋白对维生素K的包裹作用，使维生素K从奶粉中充分游离出来，并通过预先加入醇溶剂，可以有效克服酶解液和正己烷混合后出现的乳化现象并实现良好的分层，最终显著提高了奶粉中维生素K的提取效率。在此基础上，本文采用特定二维切割色谱条件对待测样品溶液进行测定，实现了维生素K很好的定性和定量，具有检测限低、精密度和准确度好的优点。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

脂肪酶：BR 级；酶活力，＞30 000 U/g；生产商，SIGMA ALDRICH；

木瓜蛋白酶：BR 级；酶活力，＞6 000 U/g；国药集团化学试剂有限公司；

无水乙醇：分析纯；纯度，99.7% ；广东光华科技股份有限公司；

正己烷：分析纯；纯度，97.0%；广东光华科技股份有限公司；

异丙醇：分析纯；纯度，99.7%；广东光华科技股份有限公司；

乙腈：色谱纯，4 升/瓶，德国默克；

甲醇：色谱纯，4 升/瓶，德国默克；

叔丁基甲醚：色谱纯（GC），纯度，≥99.9%，上海麦克林生化科技有限公司；

维生素K标准物质：维生素K（MK7），CAS：2124-57-4；纯度：99.8%；生产商：USP。

高效液相色谱仪：型号Agilent 1260 infility 中心切割二维液相色谱；生产商：安捷伦科技有限公司；

色谱柱：Agilent Extend-C18 柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）、Inertsil ODS-SP 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；

检测器：二极管阵列检测器。

1.2 检测方法

1.2.1 标准曲线溶液的配置

准确称取10 mg 维生素K标准物质于20 mL 棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，配成浓度为500 μg/mL维生素K标准储备液（4 ℃，保存3 个月）。

准确吸取1 mL 维生素K标准储备液至10 mL 棕色容量瓶中，用异丙醇定容，配成浓度为50 μg/mL 维生素K标准中间溶液。

分别准确吸取适量的维生素K标准中间溶液，配制成浓度系列为0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL 标准工作溶液。

1.2.2 仪器及其条件

本方法通过使用二维切割色谱分离法代替传统色谱分离，选择一维色谱使用Agilent Extend-C18 柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm），二维色谱使用Inertsil ODS-SP 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），一维流动相为乙腈-异丙醇体系，二维流动相为甲醇-叔丁基甲醚，利用两根不同的色谱柱进行分离，在第一维色谱中将目标物从大部分的干扰物质中切割到第二维色谱中继续分离，分析时间由原来30 min 以上，缩短为15 min 内，分析时间短。最终实现了在较短时间内使目标物与大部分杂质干扰得到分离，实现了非常好的分离效果。

本方法使用的高效液相色谱仪及其具体的参数如表1所示。

表1 仪器设备及其参数表

1.2.3 样品前处理

准确称取两个5 g 含维生素K奶粉样品（精确至0.1 mg）于两支50 mL 离心管中，记为（1）号和（2）号，同时再准确称取六个5 g 奶粉样品（精确至0.1 mg）于6 支50 mL 离心管，记为（3）号、（4）号、（5）号、（6）号、（7）号和（8）号，向（3）号和（4）号两支离心管中加入2.5 μg 维生素K标准物质，向（5）号和（6）号两支离心管中加入5.0 μg 维生素K标准物质，向（7）号和（8）号两支离心管中加入10.0 μg 维生素K标准物质；再取一支50 mL 离心管作为空白，记为（9）号，分别向这九支离心管中加入1 g 脂肪酶和0.2 g 木瓜蛋白酶，再加入10 mL 水，混合均匀后，于（37±2） ℃水浴中振荡2h，酶解后于（37±2）℃的温度下超声15 min，再加入10 mL 无水乙醇，混合均匀后，于（37±2） ℃的温度下超声15 min；最后加入10 mL 正己烷，涡旋振荡5 min。于冷冻离心机中4 000 rpm，离心5 min，吸取上层正己烷于100 mL 圆底烧瓶中。提取液再次加入10 mL 正己烷，涡旋振荡5 min，于冷冻离心机中4 000 rpm，离心5 min，合并两次提取正己烷溶液于100 mL 圆底烧瓶中。100 mL 圆底烧瓶中的正己烷溶液用氮气在（40±5） ℃的水浴中吹至近干，用异丙醇冲洗瓶壁，并准确转移至10 mL 棕色容量瓶中，定容至刻度，混匀后过0.45 μm 有机滤膜于2.0 mL 棕色进样瓶中，获得九支待测溶液。

采用同样的前处理方法，获得六个平行样品，作为精密度测定溶液。

2 结果

2.1 测定

将仪器设备按照表1中的参数进行设置和优化，使仪器设备处于最佳状态。先测定标准工作曲线溶液，获得每个标准工作曲线溶液点的峰面积；以标准工作曲线溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，如图1所示。

图1 标准工作曲线图

标准工作曲线的相关系数为0.999 84，曲线方程为y=78.622 40x+4.789 04。标准工作曲线测试完成后，依次测试空白溶液，奶粉样品溶液和低中高加标溶液，以及精密试验溶液；获得相应试验的结果，如表2和表3所示。

表2 样品及样品加标回收率结果统计表

表3 方法精密度试验结果统计表

2.2 结果统计与分析

采用本文方法测定奶粉中的维生素K，能够获得很好的准确度。如表2所示，在加标回收试验中，在奶粉样品中加标2.5 μg、5.0 μg 和10.0 μg 三个水平，三个加标水平的回收率分别为92.0%、91.8%和92.0%，不同加标浓度回收率均在90%～100%之间，加标回收率都很好。如表3所示，从精密度试验获得的数据统计，采用本文方法测定奶粉中维生素K的精密度为3.9%，小于5%，方法稳定性比较好，适合日常检测工作。

通过对试剂空白溶液的测试，获得试剂空白溶液的谱图，如图2所示。

图2 试剂空白溶液测试色谱图

通过对维生素K标准溶液的测试，获得其标准溶液的谱图，如图3所示。

通过对奶粉样品溶液的测试，获得奶粉样品中维生素K2 含量的谱图，如图4所示。

通过对比试剂空白溶液测试色谱图（如图2所示）、维生素K标准溶液测试色谱图（如图3所示）和奶粉样品中维生素K色谱图（如图4所示），样品中目标测试物维生素K的出峰处，没有其他干扰峰存在，分离效果好，出峰时间短，准确度高。

图3 维生素K2 标准溶液测试色谱图

图4 奶粉样品中维生素K2 测试色谱图

根据本文方法，标准工作曲线的最低点浓度为0.1 μg/mL，按照奶粉样品称取5 g，最后定容到10 mL 计算，检出限至少可达到0.2 μg/g，能够满足日常奶粉样品检测限值的需求。

3 结 论

本文通过加入脂肪酶和木瓜蛋白酶对奶粉样品进行酶解，酶解奶粉中的脂肪和蛋白质，能够很好地将维生素K释放出来，提取更加彻底，并结合二维液相色谱仪检测，能达到更好的分离效果，检测结果更加准确可靠。通过三个浓度水平的加标试验，其回收率均在90%～100%之间，准确度较高。检测线性范围能达到0.1 μg/mL ～5 μg/mL，相关系数为R ＞0.999，检出限达到0.2 μg/g，检测限低，灵敏度高；本方法检测奶粉中维生素K的精密度小于5%，方法稳定性好。