厄贝沙坦联合5-氟尿嘧啶对Lewis肺癌细胞增殖及ERK/PPARγ信号通路的影响Δ

翟美娟，季士亮，江翊国，白秀华#（1.南京医科大学附属苏州医院/苏州市立医院药学部，江苏苏州 1500；.苏州科技城医院呼吸科，江苏苏州 15000）

肺癌是全球病死率最高的恶性肿瘤，其死亡人数占所有癌症死亡人数的18%[1]。5-氟尿嘧啶（5-fluoruracil，5-FU）是一种常用且经典的化疗药物，可通过抑制胸苷酸合成酶阻滞DNA合成，从而发挥抗肿瘤活性，临床常用于各种实体恶性肿瘤的治疗。然而，5-FU在使用中存在耐药性和中枢神经毒性等毒副作用，限制了其临床应用[2]。因此，寻找协同增效或削弱5-FU毒性的药物是目前研究的热点。

厄贝沙坦（irbesartan，Irb）是一种血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化及抗肿瘤等特性，可通过调节机体内炎症因子的释放，发挥心脏保护作用[3]。已有研究表明，Irb与化疗药物表柔比星联用可削弱后者的毒性[4]，亦可通过抑制胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的磷酸化（即成为p-ERK1/2）来阻滞乳腺癌MCF-7细胞的增殖[5]，还可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferater activated receptor gamma，PPARγ）来诱导细胞自噬[6-7]。基于此，本研究考察了Irb联合5-FU对Lewis肺癌细胞增殖及ERK/PPARγ信号通路的影响，以期为临床肺癌治疗方案的优化提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器包括Miulab GIS-500型凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）、DMI 3000B型倒置显微镜（德国Leica公司）、BB150-2TCS型CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要药品与试剂

Irb（批号T1615，纯度99%）购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；5-FU（货号V900394-1G，纯度98%）购自美国Sigma公司；蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（批号HY-B0796）购自美国Med Chem Express公司；MTT溶液（批号CS2905）购自北京博奥森生物技术有限公司；Giemsa液（批号G1010-500）购自北京索莱宝科技有限公司；通用型Bradford蛋白定量试剂盒（批号E211-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；兔增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、肿瘤抑制蛋白 p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+p-ERK2（T185）、PPARγ、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（H&L）二抗（批号分 别 为 ab92552、ab32389、ab184699、ab201015、ab178860、ab181602、ab6721）均购自英国Abcam公司。

1.3 细胞

小鼠Lewis肺癌细胞购自美国ATCC生物标准品资源中心，货号AC-2654H。

2 方法

2.1 Irb对细胞增殖活力的影响考察

取对数生长期的Lewis肺癌细胞，用培养基稀释至1×105个/mL，吸取200 μL接种于96孔板中，用不同浓度（0、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1mmol/L[5]）的Irb处理细胞，孵育48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，避光孵育4 h后，去除培养基，再加入二甲基亚砜200 μL，用酶标仪在570 nm波长处检测光密度（optical density，OD），以OD值评价细胞增殖活力。

2.2 细胞分组与给药

取对数生长期的Lewis肺癌细胞，分为正常对照组、Irb低浓度组（1×10-3mmol/L，根据“2.1”项下实验结果设置）、Irb高浓度组（1×10-1mmol/L，根据“2.1”项下实验结果设置）、5-FU组（10 μmol/L[8]）、Irb低浓度+5-FU组（Irb 1×10-3mmol/L+5-FU 10 μmol/L）和Irb高浓度+5-FU组（Irb 1×10-1mmol/L+5-FU 10 μmol/L），除正常对照组细胞正常培养外，其余5组细胞使用相应浓度的Irb或（和）5-FU培养24 h。

2.3 Irb联合5-FU对细胞增殖活力的影响考察

按“2.1”项下方法检测“2.2”项下各组细胞培养24 h后的细胞增殖活力。

2.4 Irb联合5-FU对细胞集落形成数的影响考察

取按“2.2”项下方法分组、给药处理18 h后的细胞，制备成单细胞悬液。取单细胞悬液1 mL（细胞密度200个/mL）铺于6 cm培养皿中，于37℃、5%CO2条件下培养1～2周，每天更换1次培养基，直至出现肉眼可见的细胞增殖时终止培养，除去培养基，使用磷酸盐缓冲液浸洗2～3次，干燥后加入甲醇固定15 min，去除甲醇，晾干后，使用Giemsa液染色10 min，洗去染料，干燥后在显微镜下拍照记录细胞集落形成数（按细胞数＞50个、直径0.3～1.0 mm为1个集落）。实验重复3次。

2.5 Irb联合 5-FU 对细胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达的影响考察

采用Western blot法进行检测。取按“2.2”项下方法分组、给药处理24 h后的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗2～3次，加入含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，在4℃下裂解30 min后以15 000×g离心20 min，分离上清液即为总蛋白，测定蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸15 min变性，置于-20℃冰箱备用。每孔上样蛋白50 μg，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用TBST缓冲液冲洗3次，加入5%牛血清白蛋白（用TBST缓冲液稀释）室温封闭2 h，加入PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+p-ERK2（T185）、PPARγ和GAPDH一抗（稀释比例均为1∶500），低温孵育过夜；用TBST缓冲液冲洗3次，加入二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育2 h，用TBST缓冲液冲洗3次，显影成像。使用Image J v1.8.0软件分析条带的灰度值，按下式计算目的蛋白的表达水平：目的蛋白表达水平＝目的蛋白的灰度值/GAPDH蛋白的灰度值。实验重复3次。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 Irb对细胞增殖活力的影响

与0 mmol/L比较，Irb浓度为1×10-5、1×10-4mmol/L时细胞增殖活力无明显变化（P＞0.05），Irb浓度为1×10-3、1×10-2、1×10-1mmol/L时细胞增殖活力显著降低（P＜0.05）。后续试验选择1×10-1mmol/L为Irb高浓度（OD值为0.66±0.02），1×10-3mmol/L为Irb低浓度（OD值为0.78±0.05）。

3.2 Irb联合5-FU对细胞增殖活力和细胞集落形成数的影响

与正常对照组比较，其余5组细胞增殖活力和细胞集落形成数均显著降低/减少（P＜0.05）。与Irb低、高浓度组比较，5-FU组、Irb低浓度+5-FU组和Irb高浓度+5-FU组细胞增殖活力和细胞集落形成数均显著降低/减少（P＜0.05）。与5-FU组比较，Irb低浓度+5-FU组和Irb高浓度+5-FU组细胞增殖活力和细胞集落形成数均显著降低/减少（P＜0.05）。结果见表1、图1。

图1 Irb联合5-FU对细胞集落形成数的影响

表1 Irb联合5-FU对细胞增殖活力和细胞集落形成数的影响（±s，n＝3）

表1 Irb联合5-FU对细胞增殖活力和细胞集落形成数的影响（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与Irb低浓度组比较，P＜0.05；c：与Irb高浓度组比较，P＜0.05；d：与5-FU组比较，P＜0.05

细胞集落形成数387.12±15.26 315.27±21.03a 244.98±11.23a 182.36±8.26abc 141.25±12.02abcd 97.25±9.15abcd 589.629＜0.05组别正常对照组Irb低浓度组Irb高浓度组5-FU组Irb低浓度+5-FU组Irb高浓度+5-FU组F P OD值0.96±0.09 0.80±0.06a 0.67±0.04a 0.56±0.04abc 0.43±0.02abcd 0.26±0.01abcd 224.088＜0.05

3.3 Irb联合 5-FU 对细胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达的影响

与正常对照组比较，其余5组细胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平均显著降低，p53蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与Irb低、高浓度组比较，5-FU组、Irb低浓度+5-FU组和Irb高浓度+5-FU组细胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平均显著降低，p53蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与5-FU组比较，Irb低浓度+5-FU组和Irb高浓度+5-FU组细胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平均显著降低，p53蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。各组细胞中ERK1/2蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05）。结果见图2、表2。

表2 Irb联合 5-FU 对细胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平的影响（±s，n＝3）

表2 Irb联合 5-FU 对细胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平的影响（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与Irb低浓度组比较，P＜0.05；c：与Irb高浓度组比较，P＜0.05；d：与5-FU组比较，P＜0.05

PPARγ 1.28±0.13 1.05±0.07a 0.90±0.06a 0.75±0.07abc 0.56±0.05abcd 0.34±0.04abcd 180.063＜0.05组别正常对照组Irb低浓度组Irb高浓度组5-FU组Irb低浓度+5-FU组Irb高浓度+5-FU组F P PCNA 1.45±0.12 1.22±0.10a 0.97±0.09a 0.75±0.05abc 0.52±0.04abcd 0.27±0.01abcd 284.135＜0.05 p53 0.12±0.01 0.26±0.03a 0.47±0.05a 0.69±0.07abc 0.94±0.10abcd 1.20±0.11abcd 299.402＜0.05 p-ERK1/2 1.01±0.09 0.88±0.07a 0.76±0.06a 0.63±0.04abc 0.49±0.05abcd 0.25±0.01abcd 196.373＜0.05 ERK1/2 1.35±0.11 1.29±0.10 1.33±0.12 1.26±0.15 1.31±0.11 1.34±0.10 0.764 0.581

图2 各组细胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达的电泳图

4 讨论

PCNA是DNA合成过程中不可缺少的一种辅助蛋白，同时也是衡量肿瘤细胞增殖活性的标志物之一[9]。p53是一种肿瘤抑制蛋白，是研究最为广泛的一种抑癌因子。本研究结果显示，与正常对照组比较，Irb、5-FU单用及联用均可显著降低Lewis肺癌细胞增殖活力、减少细胞集落形成数、降低细胞中PCNA蛋白表达水平，显著提高p53蛋白表达水平；与Irb低、高浓度组比较，5-FU组、Irb低浓度+5-FU组及Irb高浓度+5-FU组Lewis肺癌细胞增殖活力、细胞集落形成数和细胞中PCNA蛋白表达水平均显著降低/减少，p53蛋白表达水平均显著升高；与5-FU组比较，Irb低浓度+5-FU组及Irb高浓度+5-FU组Lewis肺癌细胞增殖活力、细胞集落形成数和细胞中PCNA蛋白表达水平均显著降低/减少，p53蛋白表达水平均显著升高。上述结果说明，Irb和5-FU单用均可有效降低Lewis肺癌细胞增殖活力，二者联用对Lewis肺癌细胞增殖抑制作用更强。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族中最重要的一员，其本身不具备活性，只有被磷酸化后形成p-ERK才具有活性，可调控细胞增殖、分化等多个生物学过程，并可参与调节炎症因子的产生和分泌[10]。PPARγ是核受体超家族的一部分，可参与调节细胞分化、增殖、免疫/炎症反应和脂质代谢的基因表达，同时在结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞中均有表达[11]。本研究结果显示，与正常对照组比较，Irb、5-FU单用及联用均可显著降低Lewis肺癌细胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平；与Irb低、高浓度组比较，5-FU组、Irb低浓度+5-FU组及Irb高浓度+5-FU组Lewis肺癌细胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平均显著降低；与5-FU组比较，Irb低浓度+5-FU组及Irb高浓度+5-FU组Lewis肺癌细胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达水平均显著降低。上述结果说明，Irb和5-FU对Lewis肺癌细胞增殖活力的抑制作用可能与抑制ERK1/2磷酸化和PPARγ表达有关。

综上所述，Irb联合5-FU可抑制Lewis肺癌细胞增殖，且效果优于二者单用，其机制可能与下调ERK/PPARγ信号通路有关。