芪术颗粒对肝窦内皮细胞的影响及机制研究

姜心航 张荣 刘绍能 马继征 丁佳媛 刘慧敏 张玲 路迎冬

肝窦毛细血管化是肝纤维化和肝硬化的基本病理改变,一方面导致肝细胞与血液物质交换障碍,另一方面促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积,加重肝纤维化[1]。因此,抑制肝窦毛细血管化的发生,对延缓肝纤维化发展有重要意义。芪术颗粒由黄芪、白术、柴胡、茵陈、丹参、莪术等药组成,具有益气健脾、化瘀通络、利湿解毒之功效,是我院治疗肝纤维化的有效药物,临床应用已有30余年。以往实验研究证实,该药对肝纤维化模型大鼠有良好的防治效果[2-3]。本研究建立肝纤维化模型基础上分离肝窦内皮细胞,结合电子显微镜技术,从细胞、分子水平上观察芪术颗粒对肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)窗孔、表型及其毛细血管化的影响及机制,以进一步阐明该药抗纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

70只雄性Wistar大鼠,体质量180～200 g,清洁Ⅱ级,由军事医学科学院(中国北京)实验动物中心提供。这些大鼠被关在笼中,在环境控制室内(20±2℃,相对湿度36%)进行12小时的光/暗循环,允许自由获取食物和水,用标准合成饲料喂养,所有研究方案均经中国中医科学院广安门医院动物伦理委员会批准,伦理委员会受理编号为:IACUC-GAMH-2020-003。

1.2 药物

芪术颗粒(文件号:京药制字Z20063189)由中国中医药研究院广安门医院制剂室(中国北京)制备并提供,曾被列为国家“九·五”攻关项目(项目编号96-906-08-03),后又列为国家”十·五”攻关项目(项目编号2001BA701A-24)。芪术颗粒组成:黄芪15 g、莪术9 g、白术15 g、丹参15 g、桃仁10 g、茵陈15 g、郁金10 g、柴胡10 g、北豆根10 g、甘草6 g,临床用量为每次6 g,每日2次,每日总剂量12 g。动物和人类每千克体重的剂量换算系数为6.25(参考史新友编辑的《现代医学实验动物学》),大鼠的剂量为1.25 g/(Kg·d)。

1.3 试剂

四氯化碳(CCl4):分析纯,北京化学试剂公司。CCl4(阿拉丁生物,C112041-500mL);橄榄油(分析纯,北京化学试剂公司)。整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)(Abcam,ab52939);台盼蓝染色试剂盒(Beyotime,C0011);肝窦内皮细胞1抗体(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE-1)试剂(NOVUS,NB110-68095SS);血小板—内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)试剂(Affinity,AF6191);无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性胶(国药集团化学试剂有限公司,中国)、Masson染色试剂盒(Solaibao,G1340-7,中国北京)、甲苯氨蓝染色溶液(谷歌生物科技,G1032,中国武汉)。

1.4 主要仪器

病理切片机(徕卡仪器有限公司,RM2016,中国上海),立式光学显微镜(奥林巴斯,IX71),台式低速离心机[中国上海医疗设备厂医疗设备有限公司(80-2)]、振荡器[中国上海西部分析仪器厂(WH-2)]、电泳仪(泰农,EPS300)、酶标准仪(赛默,muLISKANMK3)、4℃离心机(Eppendorf,离心机5415R)、扫描电子显微镜(日立,SU8010)、FACS流式细胞仪(美国BD公司C6)。

1.5 实验方法

1.5.1 制备药物血清 雄性Wistar大鼠50只,分为芪术颗粒高、中、低三个剂量组及模型组、正常组,每组10只。芪术颗粒按1.25 g/(Kg·d)为中剂量组,中剂量的2倍剂量为高剂量组,0.5倍剂量为低剂量组;模型组与正常组与三蒸水灌胃。均每天灌胃2次,连续5次灌胃,末次灌胃后1小时于超净台中自心脏采血,收集的血液在4℃冰箱垂直静置3小时,在4℃离心机中离心3000 rpm×30分钟,离心后于超净台中无菌条件下分离出血清并于56℃水浴箱灭活血清30分钟,灭活后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

1.5.2 大鼠肝纤维化模型构建 雄性Wistar大鼠20只,大鼠适应性喂养1周后,随机取14只造模,大鼠以3 mL/Kg体重腹腔注射40%四氯化碳(橄榄油稀释)造模,每周2次,连续4周,建立肝纤维化模型。另6只大鼠作为正常组,同等条件下饲养,不造模。各组均每周称体重1次,依体重调整给药剂量。4周后处死大鼠,各组肝组织进行HE和Masson染色,观察肝组织损伤和肝纤维化情况。对照组肝小叶结构正常,肝细胞胞浆保存完好,细胞核清晰。CCl4诱导4周后,肝小叶细胞出现典型的脂肪变性、门脉和小叶炎症,即小叶细胞内有脂肪空泡、炎性细胞浸润、肝小叶内有肝小叶细胞浸润、肝小叶内有肝小叶细胞浸润,小叶中央区域的细胞肿胀和脂质变性。Masson染色显示正常大鼠无纤维增生,而模型组有纤维组织增生及纤维间隔形成,提示成功建立了肝纤维化动物模型。

1.5.3 原位分离大鼠肝窦内皮细胞 成功制作肝纤维化大鼠后,将大鼠麻醉致死,将30G无菌针头插入门静脉,切断下腔静脉。以5 mL/min的速度注射含有0.5 mm EDTA且不含Ca2+或Mg2+的HBSS 10分钟。然后以5 mL/min的速率用胶原酶和含有0.02%IV型的Ca2+和Mg2+HBSS注释10分钟。灌注结束时,小心地取出肝脏并转移到含有5%血清的DMEM中,用无菌镊子撕开肝包膜,使肝实质和非实质细胞流出。收集的细胞悬浮液以50×g的低速离心10分钟,收集上清液,沉淀以400×g的速度离心10分钟,沉淀用完整的DMEM培养基重新悬浮,并小心地添加到含有50%percoll和25%percoll的离心管中。以900×g的高速离心20分钟(无刹车)后,在25%percoll和50%percoll之间观察到明显的非必需细胞带。DMEM培养基重完全悬浮后仔细吸出,离心冲洗掉percoll液残留,加入非实质细胞悬浮液24孔板,20分钟后置于细胞培养中,不黏壁细胞悬浮后含1%离心性血内皮生长因子而5%的内皮ECM按2×106/mL悬浮接种后在鼠尾胶原包装中为6孔或96孔板。细胞在37℃和5%CO2下培养。

1.6 检测内容和方法

1.6.1 分组与处理 正常组:不造模LSECs,加正常不含药血清;模型组:造模LSECs,加正常不含药血清;低剂量组:造模LSECs,加中药低剂量药物血清;中剂量组:造模LSECs,加中药中剂量药物血清;高剂量组:造模LESCs,加中药高剂量药物血清;血清添加量为10%,于37℃、5%CO2的培养箱中培养,贴壁后换液,培养48小时后进行相关指标检测。

1.6.2 流式细胞术 当细胞生长到覆盖培养瓶80%或以上时,丢弃培养液并用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗细胞一次。用0.25%胰蛋白酶消化,加入抗兔CD31和抗鼠SE-1,4℃孵育过夜,离心,PBS冲洗,加入二抗,流式细胞仪检测PE-CD31和FITC-SE-1的表达率。实验重复三次。

1.6.3 扫描电镜观察LSECs窗孔 贴壁于盖玻片的细胞培养处理完成后弃培养基,用PBS轻轻漂洗后,弃PBS加电镜固定液室温固定2小时,再转移至4°保存。锇酸后固定,梯度脱水,临界点干燥,将样本紧贴于导电碳膜双面胶上,在离子溅射仪样品台上进行喷金30秒左右,扫描电子显微镜下观察LSECs窗孔。

1.6.4 Western Blot检测 CD31、SE-1、大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)、ITGαVβ3、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylation focal adhesion kinase,p-FAK)及MAPK的蛋白表达,收集的细胞用含有蛋白酶抑制剂的裂解液(完整,罗氏)(50 mM的Tris-Cl,pH7.4,1 mM的EDTA pH 8.0,250 mM的NaCl和1%Triton-X)裂解。使用BCA法(Beyotime P0011)测量蛋白质裂解物浓度。将10μg细胞裂解液与5倍样品缓冲液(15 g的SDS、16.6 mL的b-巯基乙醇、15.6 mL 2MTris pH6.8、57.5 g甘油)混合后,将样品装入10%聚丙烯酰胺凝胶中,SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜。用含有0.1%Tween的4%牛奶封闭后,添加以下抗体并在4℃下培养过夜:SE-1抗体、CD31抗体、aβ3抗体、FAK抗体、p-FAK抗体、MAPK抗体、p-MAP抗体、GAPDH抗体。用含有0.1%Tween的PBS溶液清洗膜3次后,添加含有0.1%吐温和HRP二级抗体(Abcam,ab6721)的4%牛奶,并在室温下培养2小时。取下膜,将ECL显影液(Bio-Rad no.170-5060)逐滴添加到膜中,并将其放入GelDoc成像系统(Bio-Rad)中拍照。蛋白表达水平用内部参考蛋白GAPDH标准化。ImageJ v1.8.0软件进行灰度分析。实验重复三次。

1.7 统计分析

统计分析采用spss 18.0软件。计量资料符合正态分布,方差齐,采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析和t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测CD31和SE-1的表达率

观察CD31与SE-1的表达。流式细胞术对各组大鼠肝窦内皮细胞的CD31阳性细胞比例和SE-1阳性细胞比例进行了检测,从结果可以看出,对照组和肝纤维化组LSECs的CD31、SE-1阳性细胞比例均在90%以上。与对照组相比,肝纤维化LSECs组的CD31阳性细胞比例和SE-1阳性细胞比例均显著升高(P＜0.05)(见图1、表1)。

图1 流式细胞术鉴定LSEC

表1 各组细胞流式细胞术检测CD31与SE-1表达结果(±s,%)

表1 各组细胞流式细胞术检测CD31与SE-1表达结果(±s,%)

注:与正常组比较a P＜0.05。

CD31 SE-1对照组组别 n 3 93.96±0.40 93.70±0.36模型组 3 95.40±0.70a 95.53±0.90 a

2.2 芪术颗粒对LSECs开窗的影响

扫描电镜下可清晰观察到LSECs的窗孔,正常组窗孔数多,而且整齐,模型组窗孔数少而稀疏,经药物血清处理后,芪术颗粒组有所恢复,尤以大剂量组明显(见图2)。

图2 LSECs扫描电镜图(50μm)

2.3 芪术颗粒对LSECs表型的影响

CD31和SE-1是常用的血管内皮标志物,在正常肝脏中很少表达。然而,这些指标在肝窦毛细血管化后肝纤维化的表达增加。Western Blot检测各组窦内皮细胞CD31和SE-1的表达。结果表明,CCl4组窦内皮细胞CD31和SE-1的表达明显高于正常组。芪术颗粒治疗后肝窦内皮细胞CD31和SE-1表达明显降低(P＜0.05),结果表明,芪术颗粒可抑制肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞CD31和SE-1的表达(图3、表2)。

表2 各组细胞CD31与SE-1表达结果(±s)

表2 各组细胞CD31与SE-1表达结果(±s)

注:与正常组比较a P＜0.05,与模型组比较b P＜0.05。

组别 n CD31 SE-1正常组3 0.10±0.01 0.13±0.01模型组 3 0.57±0.02a 0.52±0.03a芪术低剂量组 3 0.50±0.02ab 0.37±0.02ab芪术中剂量组 3 0.45±0.03ab 0.28±0.02ab芪术高剂量组 3 0.35±0.02ab 0.20±0.03 ab

图3 各组LSEC中SE-1和CD31的表达

2.4 芪术颗粒对肝窦内皮细胞整合素αVβ3-FAKRas/MAPK信号通路的影响

与正常组相比,模型组LSECs整合素αⅤβ3蛋白水平显著升高(P＜0.05),FAK、MAPK蛋白表达水平均升高(P＜0.05),提示整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白在LSECs中的表达明显增强(P＜0.05)。与模型组相比,低、中、高剂量均能抑制整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白的表达,同时能够抑制p-FAK和p-MAPK的表达(P＜0.05),并表现为一定的剂量依赖关系(见图4、5,表3)。

表3 芪术颗粒对肝窦内皮细胞整合素各蛋白表达结果(±s)

表3 芪术颗粒对肝窦内皮细胞整合素各蛋白表达结果(±s)

注:与正常组比较a P＜0.05,与模型组比较b P＜0.05。

组别 n aVβ3 MAPK FAK Ras p-MAPK p-FAK正常组 3 0.13±0.02 0.65±0.01 0.84±0.05 0.16±0.03 0.20±0.03 0.09±0.03模型组 3 0.57±0.05a 0.74±0.02 0.89±0.04 0.17±0.02 0.80±0.04a 0.66±0.06a芪术低剂量组 3 0.35±0.02ab 0.80±0.10 0.80±0.04b 0.17±0.03 0.53±0.03ab 0.48±0.05ab芪术中剂量组 3 0.26±0.02ab 0.82±0.14a 1.02±0.04ab 0.17±0.01 0.46±0.06ab 0.31±0.01ab芪术高剂量组 3 0.17±0.01b 0.67±0.02 0.78±0.01b 0.17±0.02 0.41±0.02ab 0.25±0.06 ab

图4 芪术颗粒对p-MAPK与p-FAK蛋白表达情况的影响

图5 芪术颗粒对整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白表达情况的影响

3 讨论

肝脏复杂的毛细血管网络由LSECs排列而成,正常LSECs上无隔膜的窗孔,内皮下无基底膜,有利于肝窦内物质交换,其中窗孔是肝细胞与肝窦血液间物质交流的重要通道[4]。慢性肝病中,LSECs失窗孔,内皮下出现基底膜,形成类似连续性毛细血管的结构,这一过程称为肝窦毛细血管化[5]。肝窦毛细血管化是与肝纤维化和肝硬化相关的一种基本病理变化[6-7]。肝窦毛细血管化的形成导致肝纤维化中LSECs窗孔减少,窗孔直径变小甚至消失,物质交换受阻,出现肝细胞外基质沉积、肝脏微循环障碍等一系列病变,促进肝纤维化、肝硬化的发生、发展[8]。除了特异的结构特征外,LSECs亦具有独特的表型。大鼠血窦SE-1是1993年Ohmura等发现的能和LSECs特异结合,而不和其他内皮细胞或非内皮细胞结合[9]。SE-1是大鼠LSECs的特异性标志物,已经成为鉴定大鼠LSEC最可靠的标记抗体[10]。正常肝组织LSECs很少表达CD31,而肝纤维化肝窦毛细血管化时,LSECs上调CD31等常见的血管内皮表面标志物,其表型发生变化。因此,有人提出将CD31的表达可作为LSECs表型变化的表面标志[11]。本实验显示造模后,与正常对照组相比,CD31、SE-1在肝纤维化LSECs中的表达明显增加,与上述研究一致。经芪术颗粒含药血清处理后,肝纤维化LSECs表面的CD31、SE-1表达量均在一定程度下降,并且以高剂量组最为明显,提示芪术颗粒可改变LSECs细胞表型,从而增强了纤维化的消退,从而发挥抗肝纤维化的作用。

整合素ανβ3在正常肝组织中很少表达,但在血管生成过程中其表达上调。最近的研究表明,整合素ανβ3的上调是血管重建的关键受体分子,也是血管生成的常见生物标记物[12-13]。在大鼠纤维化模型中发现整合素ανβ3表达与肝纤维化进展一致,随着肝纤维化的加重,CD31表达增加,提示肝纤维化进展中整合素ανβ3表达水平增加与血管新生有关,并参与间质重建。研究表明,整合素ανβ3表达水平随肝纤维化发展而升高[14]。FAK是一种重要的整合素相关酪氨酸激酶信号蛋白。在肝纤维化过程中,LSEC中整合素水平升高,FAK是整合素信号通路中的一个重要细胞因子,通过调节下游Ras、MAPK信号通路参与血管生成,并在促进纤维化中发挥作用,而抑制FAK可起到抗纤维化治疗作用[15]。本实验结果表明,整合素ανβ3蛋白可参与介导LSECs表面CD31、SE-1蛋白的表达,对LSECs窗孔进行调节,其抗纤维化作用可能与其调节整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路有关。

在以往的临床中,我们发现慢性肝病-肝纤维化-肝硬化这一动态过程与气滞-入络-血瘀动态变化非常相似,故可按络脉理论认识肝纤维化[16-17]。亦有学者认为肝纤维病机主要为正虚血瘀,轻者在气,重者入血入络[18]。由此提出肝纤维化的病机关键是在毒损肝络的基础上形成”毒瘀肝络”。芪术颗粒由黄芪、莪术、白术、柴胡、茵陈、丹参、桃仁等药组成,方中黄芪有益气补虚之功,为补气要药,《本草备要》言:“黄芪能温三焦,壮脾胃,生血生肌。”莪术有破血行气,消积止痛之功,取其破血之力以消散肝中之瘀结,如《本草经疏》言:“主积聚诸气,为最灵之药。”两药合用乃气血同治,扶正祛瘀,攻补兼施。白术健脾以助黄芪益气;丹参、桃仁助莪术活血化瘀。茵陈等清热利湿解毒,柴胡等疏肝解郁,理气通络。本方具有益气健脾、化瘀通络、利湿解毒之功效,有较好的抗肝纤维化的作用。芪术颗粒含药血清可通过减轻CCl4诱导的肝纤维化大鼠LSECc失窗孔,使窗孔孔径、数量发生变化,使其通透性得到改善,同时可通过改变LSECs表型及减少毛细血管的增值以减轻肝窦毛细血管化,其机制与其调控整合素αⅤβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路有关。

本研究从络病理论认识肝纤维化,从肝窦内皮细胞及信号通路进行研究,将中医药治疗与肝窦内皮细胞、信号通路相联系,从分子水平上深化了中医络病理论的研究基础。但芪术颗粒是否调控其他信号通路,是否调控该信号通路上的其他分子仍需进一步研究。