复合填料ANAMMOX系统脱氮效能及微生物群落研究

杨一飞，杨津津，李绍康，罗景文，常根旺，周继红，李 翔*

1. 河北工程大学能源与环境工程学院，河北 邯郸 056038

2. 中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

随着城市人口和工业需求的扩大，生活、养殖、化肥工业等产生的含氮废水排放量逐年增加[1-2]，而传统生物脱氮工艺处理能耗和成本较高，致使人们开始寻找新的脱氮思路. 1995年，Mulder等[3]在流化床反应器中观察到ANAMMOX现象，并命名为“厌氧氨氧化”，这一发现为含氮废水处理提供了新思路.ANAMMOX工艺具有节省曝气、剩余污泥产量少和无需外加碳源等优点[4]，是一种经济、环境友好的废水生物脱氮工艺. 但是由于厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长周期长(倍增时间在11~14 d)，细胞产率低，污泥易流失[5-6]，导致AnAOB难以富集，极大程度地限制了ANAMMOX工艺的工程化应用.

为高效富集AnAOB，研究人员常在反应器中添加填料以提高反应器的生物截留性能和脱氮能力. 佟智达等[7]在EGSB反应器中加入填料，80 d后反应器成功启动，160 d后，TN容积负荷(NLR)达到0.88 kg/(m3·d). 不同材质和结构的填料对微生物的富集作用不一，目前研究中常用的填料有海绵填料、塑料填料、活性炭填料、纤维填料和组合填料等，其中活性炭具有吸附特性，可以选择性地吸附疏水蛋白，有利于形成良好的疏水ANAMMOX生物膜[8-9]. 有研究[10-11]表明，活性炭还具有电子转移能力，可以通过刺激ANAMMOX体中关键酶活性诱导AnAOB的生长.Liu等[12]以活性炭为载体，仅用17 d就成功启动了ANAMMOX系统，并在活性炭表面发现了大量红色ANAMMOX污泥. 组合填料具有较大的比表面积，亲水性能好，对微生物亲和性高，有利于菌体附着.Wang等[13]对比研究了组合填料和立体性纤维载体对ANAMMOX工艺脱氮效能的影响，发现组合填料结构更有利于AnAOB的稳定附着、增殖和聚集. 目前，ANAMMOX系统中关于菌种高效富集的研究多集中于在反应器启动初期加入填料，然而在反应器运行的不同时期，污泥形态和氮素浓度处于时刻变化中，根据系统运行实际情况选择性添加合适填料的研究鲜见报道.

该研究在ANAMMOX系统运行的不同时期分别加入活性炭填料和组合填料，构建复合填料ANAMMOX系统，通过探究复合填料ANAMMOX系统在启动和运行过程中的脱氮性能和微生物群落结构变化特征，阐明填料对AnAOB富集效能的影响，以期为AnAOB的高效富集提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验装置

图1为试验装置示意图. 装置主体是由有机玻璃制成，内径10 cm，有效高度90 cm，有效容积7 L，试验采用人工模拟废水，由蠕动泵将废水从反应器底部泵入，经过顶部三相分离器进行气、液、固分离后，经溢流槽排出. 反应器中排出的气体由集气瓶进行收集，温度由反应器水浴层控制. 另外，为避免光照对ANAMMOX反应的影响，反应器表面用黑色塑料袋包裹.

图1 试验装置示意Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

图2为试验装置内的填料. 试验中使用的活性炭外观呈黑色柱状，粒径约为1 mm，使用前用蒸馏水反复清洗以去除表面杂质. 组合填料由纤维素、聚乙烯塑料和中心绳构成，采用螺旋铁丝将其固定在反应器中，增加与污泥的接触面积.

图2 试验装置内的填料Fig.2 Fillers in the experimental equipment

1.2 接种污泥

接种污泥包括厌氧污泥、好氧活性污泥和ANAMMOX污泥(见图3)，其中，厌氧污泥和好氧活性污泥分别取自某工厂污水处理站的厌氧池和二沉池，ANAMMOX污泥取自某生产性ANAMMOX装置，占非ANAMMOX污泥体积的3.25%，试验装置中接种的混合污泥浓度(MLSS)为6 100 mg/L. 污泥接种前，先用清水将其冲洗3次，以去除污泥表面的残留基质.

图3 试验接种污泥Fig.3 Experimental inoculated sludge

1.3 试验用水

试验采用人工配制的模拟废水，以(NH4)2SO4和NaNO2为氮源，其他组分包括NaHCO31 250 mg/L、MgSO4·7H2O 300 mg/L、KH2PO410 mg/L、CaCl25.6 mg/L，微量元素Ⅰ 1 mL/L，微量元素Ⅱ 1 mL/L[14]，微量元素主要成分如表1所示. 同时，在进水中额外投加了无水Na2SO3，采用化学还原脱氧法以降低进水中的溶解氧，达到脱氧效果，如式(1)所示.

表1 微量元素的配比Table 1 The ratio of microelement

1.4 试验分析项目及检测方法

NH4+-N、NO2−-N和NO3−-N浓度参考《水和废水的监测分析方法(第四版)》，分别采用纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法测定；总无机氮浓度为NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N三者浓度之和；pH采用便携式pH计(pH-100A，力辰科技)检测.

采用16S rRNA高通量测序技术研究复合填料ANAMMOX系统中的微生物多样性和群落结构. 样品取自复合填料ANAMMOX系统中运行第30天、第60天和第160天时的ANAMMOX污泥.

1.5 复合填料ANAMMOX系统运行工况

复合填料ANAMMOX系统在冬季启动，初期启动温度为23~26 ℃. 随着季节的变化，在复合填料ANAMMOX系统运行60 d后温度逐步达到27~30 ℃，pH为7.5±0.2，ρ(DO)为0.6 mg/L. 试验采用逐步提高进水基质浓度〔ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)〕和缩短水力停留时间(HRT)两种方式提高复合填料ANAMMOX系统容积负荷，试验运行工况见表2.

表2 复合填料ANAMMOX系统的运行工况Table 2 Operation condition of ANAMMOX system with combined fillers

2 结果与讨论

2.1 复合填料ANAMMOX系统脱氮效果

第Ⅰ阶段(1~25 d)为菌体自溶期，进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)分别为33.3和35.3 mg/L，HRT为24 h，温度为23~26 ℃. 如图4(a)所示，第Ⅰ阶段由于接种污泥中存在较多不适应无机营养环境的异氧菌，导致大量细胞出现自溶解体现象[15]，污泥中有机物分解产生NH4+-N，造成出水ρ(NH4+-N)高于进水ρ(NH4+-N).而污泥中的反硝化微生物直接利用NO2−-N和菌体自溶过程中释放的有机碳源进行反硝化作用[16]，使复合填料ANAMMOX系统出水ρ(NO2−-N)低于进水ρ(NO2−-N)，NO2−-N的去除率在85%以上〔见图4(b)〕.同时，NO3−-N浓度几乎接近于0，氨化作用和缺氧反硝化作用占主导，ANAMMOX作用尚未显现.

第Ⅱ阶段(26~94 d)为活性提高期，在复合填料ANAMMOX系统运行第26天时加入占试验装置有效容积15%的活性炭. 如图4(a)所示，第26天出水ρ(NH4+-N)迅速降低，第37天时，NH4+-N和NO2−-N的去除率均达到95%，TN的去除率达到84.31%. 赖玮毅等[17]研究表明，活性炭具有物理吸附和生物降解的协同作用. 在菌体自溶期结束后加入活性炭，此时污泥中的大部分有机质已被分解，避免了活性炭的吸附能力被无效占用. Zhang等[18]在反应器运行一段时间后加入活性炭，NH4+-N和NO2−-N的去除率分别提高到93.07%和80.92%，表明在反应器运行一段时间后添加活性炭填料，有利于提高反应器的传质能力和脱氮性能.

复合填料ANAMMOX系统在低基质负荷下稳定运行后，对进水基质浓度进行多次小幅提升，在第43天进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)分别提高至86.2和93.0 mg/L，第65天 进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)分别提高至169.8和199.8 mg/L. 由图4(b)可知，在2次进水氮负荷提升过程中，NH4+-N和NO2−-N的去除率均保持在90%以上. 第76天TN的去除率达到85%，再次将进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)分别提高至283.8和314.0 mg/L. 第80天时，复合填料ANAMMOX系统受到高负荷冲击，出现抑制现象，TN的去除率降至60%. 为使脱氮性能恢复，通过翻动活性炭床和降低基质浓度对复合填料ANAMMOX系统进行调控. 由图4(b)(c)可知，复合填料ANAMMOX系统运行第94天时，NH4+-N和NO2−-N的去除率恢复至90%以上，NLR和TN容积去除负荷(NRR)分别达到0.51和0.43 kg/(m3·d)，TN容积负荷去除率(NRE)达到84.5%. 活性炭的吸附特性为过量的底物提供了临时存储场所，提高了反应器在高NLR冲击下的耐受能力[19].

第Ⅲ阶段(95~160 d)为稳定运行期，水力停留时间由24 h减至16 h. 该阶段复合填料ANAMMOX颗粒污泥数量明显增加，考虑到活性炭在复合填料ANAMMOX系统中处于流动状态，不易使大量颗粒污泥固定在填料上. 为加快AnAOB富集，第95天在试验装置中添加组合填料，构建复合填料ANAMMOX系统. 第140天时，进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2−-N)分别提高至306.1和340.8 mg/L，NH4+-N和NO2−-N的去除率均保持在90%以上，TN的去除率达到85.29%.由图4(c)可知，在160 d时，NLR和NRR分别达到0.97和0.83 kg/(m3·d). 彭永臻等[20]提出，通过投加合适的填料，AnAOB的群体感应现象增强，最终实现AnAOB的良好聚集和复合填料ANAMMOX系统脱氮性能的有效提升. 试验中由于组合填料通过铁丝螺旋固定在反应器中，不易受到水流冲击，并且具有较强的韧性和较大的比表面积，使菌体大量附着不易脱落，生物膜逐渐趋向成熟，促使复合填料ANAMMOX系统脱氮效果趋于稳定化.

图4 运行期间反应器的脱氮性能Fig.4 Nitrogen removal performance of the reactor during operation

2.2 活性提高期及稳定运行期化学计量比变化

复合填料ANAMMOX系统成功启动的重要参考标准之一是△NO2−-N/△NH4+-N(NO2−-N和NH4+-N的消耗量之比，下同)为1.32，△NO3−-N/△NH4+-N(NO3−-N生成量与NH4+-N的消耗量之比，下同)为0.26[21-22]， ANAMMOX反应的化学方程如式(2)[23]所示. 然而在实际情况中，由于复合填料ANAMMOX系统运行条件和菌群结构不同，NH4+-N的消耗量和NO3−-N的生成量常常与理论值有所出入. 如图5所示：26~33 d时，复合填料ANAMMOX系统中△NO2−-N/△NH4+-N和△NO3−-N/△NH4+-N的波动均较大，且均明显高于理论值，这说明复合填料ANAMMOX系统中AnAOB的活性表现甚微，异养反硝化反应占主导[24]；33~78 d和95~160 d时，△NO2−-N/△NH4+-N和△NO3−-N/△NH4+-N均 接近于理论值，但都略低于理论值，这可能与复合填料ANAMMOX系统中的绿弯菌门微生物有关[25-26]；79~93 d，复合填料ANAMMOX系统处于失稳状态，出现△NO3−-N/△NH4+-N高于理论值，△NO2−-N/△NH4+-N略低于理论值的现象. 复合填料ANAMMOX系统中AnAOB和多种菌种相互作用易造成化学计量比(△NO2−-N/△NH4+-N和△NO3−-N/△NH4+-N)偏差，同时由于试验为人工模拟废水，进水浓度配比与理论化学计量比存在一定差距，这也是一个不可忽视的因素.

图5 活性提高期及稳定运行期化学计量比的变化Fig.5 Variation of stoichiometric ratio of activity improvement stage and stable operation stage

2.3 ANAMMOX颗粒污泥形态变化

在复合填料ANAMMOX系统运行过程中，污泥颜色变化可以作为判定复合填料ANAMMOX系统中菌群变化的依据，研究表明，AnAOB的细胞内含有大量的细胞色素C，使污泥外观呈现独特的红色[27]. 当复合填料ANAMMOX系统中出现大面积红色污泥时，说明AnAOB成功富集. 复合填料ANAMMOX系统运行第30天时污泥整体呈现黑色〔见图6(a)〕，细胞自溶期污泥颜色未发生明显变化，活性提高期污泥颜色逐渐变浅，由黑色逐渐变为黄褐色〔见图6(b)〕.经过提高负荷培养后，污泥颜色逐渐变为红褐色. 在稳定运行期间红色加深，有明显的颗粒状〔见图6(c)〕，表现出较强ANAMMOX活性，说明AnAOB成功得到富集.

图6 不同时期污泥的表观变化Fig.6 Apparent changes of sludge at different stages

在复合填料ANAMMOX系统运行160 d的过程中，活性炭表面包裹着AnAOB，但相对于组合填料，活性炭富集AnAOB的效果较弱. 组合填料表面有大量的AnAOB附着，填料表现出明显红色，大量的ANAMMOX污泥聚集形成生物膜(见图7). 研究表明，当AnAOB达到一定活性时就会引发群体感应现象，使周围菌群活性和生长速率得到提高[28]. 因此，复合填料ANAMMOX系统为AnAOB提供了适宜的生长条件，对AnAOB的富集起到了良好的促进作用.

图7 生物膜的表观特性Fig.7 Apparent properties of biofilms

2.4 微生物群落特征分析

2.4.1 微生物多样性分析

为考察复合填料ANAMMOX系统运行过程中的微生物群落变化特征，通过高通量测序对第30天、第60天和第160天的污泥样品进行微生物多样性分析. 由表3可知，Coverage覆盖率均大于99%，表明检测样品的细菌可以代表复合填料ANAMMOX系统内大部分微生物群落的变化情况. Chao1指数、Ace指数可以反映群落多样性，与Shannon-Wiener指数成正比，与Simpson指数成反比. 30~60 d时，NLR由0.07 kg/(m3·d)提至0.19 kg/(m3·d)，微生物丰富度和多样性呈现上升趋势，OTU数由923增至1 039，该阶段微生物逐渐适应新环境导致群落丰度提高. 随着ANAMMOX活性逐渐显现，脱氮性能逐渐增强，第160天时，NRR提升到0.83 kg/(m3·d)，群落的丰富度呈现下降趋势，系统经过菌种筛选，部分不适应环境的微生物被淘汰，功能菌逐渐占据主导地位.

表3 微生物群落的多样性指数Table 3 Diversity index of microbial community

2.4.2 门水平上物种相对丰度分析

由图8可见：第30天时，复合填料ANAMMOX系统中门水平的微生物主要包括浮霉菌门(Planctomycetotes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)、脱硫菌门(Desulfobacterota)和变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度分别为0.77%、9.17%、16.88%、17.13%和32.25%；第60天时，复合填料ANAMMOX系统中浮霉菌门、绿弯菌门和拟杆菌门的相对丰度分别提高至2.29%、17.28%和23.04%，变形菌门和脱硫菌门分别降至24.82%和10.82%；第160天时，浮霉菌门和绿弯菌门的相对丰度分别提高至33.17%和22.65%，变形菌门、脱硫菌门和拟杆菌门的相对丰度分别降至19.21%、0.50%和7.49%.

图8 不同时期门水平上微生物相对丰度的变化Fig.8 Changes in relative abundance of microorganisms at phylum level at different stages

AnAOB属于化能自养生物，是浮霉菌门的重要组成部分，在复合填料ANAMMOX系统稳定运行第160天时，浮霉菌门占优势地位. 值得一提的是，在第80天时脱氮性能有所下降，这可能与复合填料ANAMMOX系统正在经历筛菌过程，造成附属脱氮菌种的生物量减少有关. 经过一段时间的适应，AnAOB成为主导，复合填料ANAMMOX系统脱氮效果恢复. 此外，据报道[29]显示，绿弯菌门与AnAOB处于协同作用，其丝状结构能够促进ANAMMOX生物膜的形成，故复合填料ANAMMOX系统中绿弯菌门的相对丰度逐渐升高. 变形菌门和拟杆菌门为复合填料ANAMMOX系统中的重要菌群，这与已有研究结果[30-31]一致. 同时，第60天和第160天这两个时期的化学计量比均小于理论值，该现象可能归因于绿弯菌门相对丰度的提高. 变形菌门中包含了亚硝酸盐氧化细菌和反硝化细菌等多种脱氮功能菌[32-33]，能促进脱氮过程的进行，拟杆菌门也可以参与部分反硝化作用实现废水脱氮[34-35]，但由于复合填料ANAMMOX系统中缺乏足够的有机碳源供应，这两种菌门对复合填料ANAMMOX系统的适应性较低，故随着时间的推移逐渐被淘汰，变形菌门和拟杆菌门的相对丰度整体呈现下降趋势.

2.4.3 属水平上菌群结构分析

由图9可见，第30~60天，反硝化菌Denitratisom的相对丰度由7.75%提升至12.17%，占据重要地位.虽然反应初期接种了ANAMMOX污泥，但接种量甚微，第30天和第60天均未检测到明显的ANAMMOX菌属，ANAMMOX活性仍处于劣势. 在第160天时，随着进水氮负荷的提升和复合填料ANAMMOX系统的构建，无机环境对反硝化菌起到了抑制作用，反硝化菌整体呈现下降趋势.norank_f_norank_o_SBR103的相对丰度从2.69%升至9.84%，norank_f_norank_o_SBR10作为厌氧菌，属于绿弯菌门的Anaerolinea纲，是菌胶团的重要组成部分，起到辅助脱氮作用[36]. 此外，第160天时在复合填料ANAMMOX系统中检测出了AnAOB菌属Candidatus Jettenia和Candidatus Brocadia，其相对丰度分别为30.56%和1.93%. 可见，AnAOB倾向于聚集生长，向复合填料ANAMMOX系统中投加填料可以为AnAOB聚集生长提供更好的环境.

图9 不同时期属水平上微生物相对丰度的变化Fig.9 Changes of relative abundance of microorganisms at genus level in different periods

3 结论

a) 该研究成功构建了复合填料ANAMMOX系统，稳定运行期NLR和NRR最大值分别为0.97和0.83 kg/(m3·d). 复合填料ANAMMOX系统具有良好的稳定性，抗冲击负荷能力强，AnAOB表现出良好的自我聚集能力.

b) 高通量测序分析表明，复合填料ANAMMOX系统运行过程中微生物多样性降低，浮霉菌门和绿弯菌门的相对丰度得到提升，而其他菌属的相对丰度呈现下降趋势. 通过提升进水氮负荷以及先后投加活性炭和组合填料，AnAOB得到有效富集，AnAOB优势菌属Candidatus jettenia和Candidatus brocadia的相对丰度分别提升至30.56%和1.93%.