绞股蓝总黄酮的提取工艺及抑菌性质

张亦琳，延 永，张 琴

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

绞股蓝[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino]为葫芦科植物的全草，又名小苦叶、七叶胆等，味苦、微甘，性凉，具有清热、补虚、解毒的功效，有“第二人参”和“南方人参”之称，对治疗病毒性肝炎、慢性支气管炎、体虚乏力等症有确切的疗效[1,2]。卫健委(原卫计委)将其列为保健食品的中药，常被制成保健茶、饮料、食品添加剂等功能性食品[3]。绞股蓝在陕西商南地区广泛种植，陕西省政府在《陕西省道地中药材志》中将绞股蓝确定为重点中药材品种[4]。绞股蓝总提取物成分复杂，包含多糖、皂苷[5, 6]、黄酮[7]等，其中总黄酮含量约3%～5%[8]，主要有商陆素、芦丁、槲皮素及芸香苷等十余种[9]。提取方法有常规溶剂回流法、超声辅助提取、微波辅助提取等[10]，很少有人考虑浸泡对提取效果的影响。研究表明，植物浸泡后有助于提取有效成分，提高提取得率[11]。

为提升绞股蓝药材资源利用率，提高产品效价，以陕西道地药食两用的中药材绞股蓝为研究对象，在回流提取绞股蓝中总黄酮的工艺的基础上，增加溶剂浸泡，通过单因素试验和Box-Behnken响应面法，优化绞股蓝总黄酮的提取工艺，并对绞股蓝总黄酮提取物的抑菌活性进行研究，为绞股蓝总黄酮提取工艺开发提供新的思路，对绞股蓝功能产品开发提供了理论基础。

1 仪器与试剂

UV-255型紫外分光光度计(大连市仪器制造公司)、ZYMICRO-I-10T型超纯水机(成都鼎越水处理设备有限公司)、DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)

绞股蓝(商洛本地产，购于商洛市怡康大药房)、芦丁标准品(南京道斯夫生物科技有限公司)；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 实验方法

2.1 标准曲线绘制

芦丁标准品溶液的制备参考文献方法[12]：配置质量浓度分别为0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0160、0.0200、0.0240 mg/mL的芦丁标准品稀释液，测定吸光度值(A)。以芦丁标准品溶液的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=9.9431X+0.00231(R2=0.99718)。

2.2 总黄酮含量的测定

取一定量的提取液，按芦丁标准品溶液的方法处理后于510 nm处测定吸光度(A)，通过标准曲线方程计算绞股蓝总黄酮浓度，由下式计算提取率Y(%)。

其中，C(g/mL)为提取液质量浓度；N为稀释倍数；V为提取液体积(mL)；W为药材总质量(g)。

2.3 单因素试验

称取绞股蓝5 g，以乙醇浓度为70%，溶剂体积50 mL，浸泡时间30 min，提取温度70℃，提取时间120 min为基础提取条件，调整乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇浓度对提取的影响；调整溶液体积分别为12.5 mL、25 mL、50 mL、75 mL和100 mL，考察料液比对提取的影响；调整浸泡时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察浸泡时间对提取的影响；调整提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，考察提取温度对提取的影响；调整提取时间分别为60 min、90 min、120 min、150 min、180 min考察提取时间对提取的影响。

2.4 Box-Behnken响应面试验设计

基于单因素试验结果，以乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)为自变量，用-1、0、1分别表示自变量的高低水平，以总黄酮提取率为评价指标，设计三因素响应曲面试验，因素与水平如表1所示。

表1 因素和水平

2.5 验证性试验

为了验证响应面优化结果的可靠性，对预测的最佳提取条件进行验证，确定与预测值的吻合程度。如果与预测值基本吻合，说明预测模型与实际情况拟合较好，反之则拟合失败。

2.6 绞股蓝总黄酮提取物抑菌活性测定

在灭菌环境下，将100.0 μL菌种种植在琼脂培养基内，密封，摇匀，置于培养箱中18 h(37℃)。取滤纸片(灭菌，d=7.00 nm)蘸取高、中、低剂量物溶液和安息香酸钠溶液后(浓度见表4)，将其密封在涂有菌悬液的培养基，在37℃条件下培养18 h，计算抑菌率W(%)。

其中：A为测试液抑菌圈直径/mm；B为安息香酸钠抑菌圈直径/mm；d为滤纸片直径/mm。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 乙醇浓度对绞股蓝总黄酮提取的影响 由图1可知，因乙醇渗透能力较强，提高乙醇浓度能加速目标成分在提取液和细胞基质之间的溶解平衡，所以随乙醇浓度的增大，绞股蓝总黄酮含量逐渐上升；当乙醇浓度达到80%时，总黄酮的含量达到最大值。但是，由于黄酮类化合物极性较大，根据相似相溶原理，继续升高乙醇浓度，总黄酮溶解度降低。因此，选用乙醇浓度在60%、70%、80%三个水平进行响应面试验。

图1 乙醇浓度对绞股蓝总黄酮提取的影响

3.1.2 料液比对绞股蓝总黄酮提取的影响 由图2可知，随着料液比的增大，绞股蓝总黄酮的提取率也逐渐减大，当料液比为1∶10时，总黄酮提取率达到3.47%。继续增大料液比，绞股蓝总黄酮提取率逐渐减小，可能是由于随着液料比减小，绞股蓝样品的其他成分也随之溶出，影响了黄酮类化合物的溶解度。因此，选择料液比1∶5、1∶10、1∶15三个水平进行响应面试验。

图2 料液比对绞股蓝总黄酮提取率的影响

3.1.3 浸泡时间对绞股蓝总黄酮提取的影响 如图3所示，溶剂浸泡有利于中药活性成分的析出，随着浸泡时间的增长，绞股蓝总黄酮提取率有明显增加，当浸泡时间达到30 min时，提取率达到最大值3.23%，继续增加浸泡时间，提取率基本不再增加，从时间成本和提取效率上考虑，选择浸泡时间为30 min，不做响应面研究。

3.1.4 提取温度对绞股蓝总黄酮提取的影响 由图4可知，当提取温度不断升高时，绞股蓝总黄酮的含量也随着升高，当提取温度达到60℃时，总黄酮提取率最大值为3.31%。继续升高提取温度，总黄酮提取率出现下降趋势，可能由于随着提取温度的升高，绞股蓝中的氨基酸、多糖等的溶出影响了黄酮类化合物的析出(提取液变黑，有少量黑色沉淀出现)。因此，选择提取温度为50℃、60℃、70℃三个水平进行响应面实验。

图3 浸泡时间对绞股蓝总黄酮提取率的影响

图4 提取温度对绞股蓝总黄酮提取率的影响

3.1.5 提取时间对绞股蓝总黄酮提取的影响 由图5可知，在提取时间少于120 min时，总黄酮提取率随着提取时间的增加而增大，且增大的趋势增强，当提取时间达到120 min时，绞股蓝总黄酮提取率达到最大值，继续延长提取时间，提取率变化不大。因此，选择120 min作为绞股蓝总黄酮的提取时间，不做响应面优化。

图5 提取时间对绞股蓝总黄酮提取的影响

3.2 响应面试验结果与分析

3.2.1 响应面试验方案及试验结果 以A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(提取温度)作为考察因素，绞股蓝总黄酮的提取率为响应值，利用Design-Expert8.0.6Trial 软件对数据进行多元回归分析，结果见表2，并建立参数回归模型。

表2 试验设计方案及结果

模拟回归方程为：总黄酮提取率= 0.37-7.125×10-3A-0.012B+0.013C-0.019AB +1.200×10-3AC+7.825×10-3BC-0.053A2-0.13B2-0.099C2

3.2.3 响应面各因素交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6Trial 软件对绞股蓝总黄酮的提取工艺的相关因素做出响应面曲线图。如图6a、6b、6c可见，AB、AC、BC三个3D相应曲面曲线陡峭，说明各因素对总黄酮含量影响较显著，当变量发生变化时能对绞股蓝总的提取影响明显如图6d、6e、6f可见，AB、AC、BC三个等高线图呈现明显的椭圆形，尤其是乙醇浓度和提取温度、乙醇浓度和料液比交互作用较强。

表3 方差分析

图6 两因素交互作用对总黄酮得率的响应面图和等高线

3.2.4 最佳提取条件的确定 根据Design-Expert8.0.6Trial 软件模拟模型，分析最佳的提取工艺为：乙醇浓度79.75%，提取温度59.40℃，料液比1∶10.13，预测最佳工艺的总黄酮的提取率为3.71%。

3.2.5 总黄酮验证性实验 充分考虑实验的可行性，将预测的最佳工艺调整为乙醇浓度80.0%，提取温度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡时间30 min，回流时间120 min。平行3次验证，总黄酮提取率分别为3.84%、3.77%、3.79%，平均值为3.80%(RSD=94.88%)，与预测值相符。验证实验证明该工艺具有稳定性。

3.3 绞股蓝总黄酮提取物体外抑菌活性测试结果

绞股蓝总黄酮提取物对8种测试菌均有抑菌效果，如表4所示：

表4 不同浓度绞股蓝提取物对不同菌种的抑菌作用

结果表明，绞股蓝总黄酮提取物对8种测试菌的抑菌活性与提取物浓度关系密切，随着总黄酮的浓度增加，抑菌圈直径变大。高剂量时对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸钠(3.28 mg/mL)，抑制率分别增加103.30%和98.61%；对肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、铜绿假单胞菌的抑制效果相对较差，抑制率不超过50%。

4 结论与讨论

本工艺新增考虑溶剂浸泡对绞股蓝总黄酮提取的影响，通过Box-Behnken设计中的响应面优化试验，成功优化得到绞股蓝总黄酮提取的最佳工艺为：乙醇浓度80.0%，提取温度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡时间30 min，回流时间120 min，绞股蓝总黄酮的提取率的平均值为3.80%(RSD=94.88%)。绞股蓝提取过程中，乙醇浓度对提取的影响较为显著，与之前文献报道一致，这也是绞股蓝提取物大部分为醇提物的原因，经验证，总黄酮提取物的成分较为复杂，另一种有效成分的绞股蓝皂苷的含量达到2.6123 mg/mL，后续研究重点应该在提取物有效成分的分离和纯化，相关研究工作已经启动。

抑菌实验表明：绞股蓝总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌8种测试菌均有抑制活性，尤其是高剂量提取物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸钠(3.28 mg/mL)，抑制率分别增加103.30%和98.61%；因此，我们有理由认为绞股蓝的总黄酮提取物具有较好的实用价值，开发提取工艺和研究提取物的生物活性具有一定的实际意义。