锦鸡儿花及根中酚性物质的含量及其抗氧化作用的比较研究

刘明秀，邹秋萍，刘绍科，何 瑞，付康敏，李艳平

(云南中医药大学 中药学院、云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500)

0 引言

锦鸡儿(Caraganasinica(Buc'hoz) Rehder)为豆科锦鸡儿属植物[1]，异名金雀花、金鹊花、阳雀花、黄雀花、斧头花等。主要分布于新疆、浙江、河北、山东、江西、江苏、四川、湖南、河南、福建、贵州和云南等地[2]。据《药用植物辞典》记载，该植物的根、花等部位均可入药[3]。锦鸡儿在民间用作滋补强壮药，因此也有地区称之为土黄芪或直接充作黄芪用[4]。对该植物化学成分的研究表明锦鸡儿中主要有三萜、黄酮、生物碱、二苯乙烯、苯丙素、有机酸类化合物[5～7]，其药理作用包括降压、抗炎、免疫抑制、血栓抑制、平喘、抑菌、抗肿瘤及镇痛作用等[8]。锦鸡儿花营养成分丰富，是天然无污染的食物。花及花蕾洗净后素炒、炒鸡蛋、炒肉丝、炖猪肉及蒸鸡蛋，烹制许多种菜肴，风味独特，色味俱佳[9]。除食用价值，锦鸡儿花还具有祛风活血，止咳化痰的作用，可用于头晕耳鸣，肺虚咳嗽，小儿消化不良[10]。而锦鸡儿根又名白心皮、金雀花根、土黄芪。《中华本草》记载: 锦鸡儿根味甘、辛、微苦，性平，归肺、脾经[11]，在民间被作为治疗虚症、血管性高血压、白斑、瘀伤和挫伤的草药[12]。锦鸡儿根中所含的化学成分主要为甾醇、皂苷以及二苯乙烯低聚物，生理活性显著[13]。尽管锦鸡儿花和根具有很高的食用和药用价值，在中国的大部分地区仍然仅仅将其用于防风固沙以及牲畜的饲料，因此，对于锦鸡儿的二次开发具有重要的意义。

随着我国人口老龄化的加快，癌症和一些老年性疾病的发病率和死亡率日益增多，这些疾病多与体内的自由基氧化反应有重要关系，因此，寻找一种新颖、有效的自由基清除剂即抗氧化剂来预防和减少老年疾病的发生、减缓人体的衰老过程意义重大[14]。而植物来源的多酚以及黄酮类化合物多具有很强的抗氧化功效[15]。结合前期对锦鸡儿的文献调研，前人对锦鸡儿的化学成分，栽培技术以及活性方面做了相关研究，且在抗炎，抗肿瘤等方面有良好的活性，在抗氧化方面也有一定研究意义。笔者实验首次研究锦鸡儿根及花中酚性物质含量以及抗氧化活性，以及它们所表现出来的对氧自由基的清除能力，为抗氧化产品开发提供理论支持。因此，笔者试验以锦鸡儿花及根为原料，分别以85%乙醇回流提取其活性成分，后经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取获得不同萃取部位，测定各萃取部位的总黄酮、总多酚含量，并采用DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和铁离子还原能力3种方法评价其抗氧化活性，以期更好的对锦鸡儿进行综合分析评价，为锦鸡儿资源的开发利用提供新的理论依据及方向。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

锦鸡儿花及根样品各500g采购于贵州省铜仁市野生药材批发市场；DPPH(1, 1-二苯基-2-苦基肼基自由基)、TPTZ、ABTS、芦丁标准品、没食子酸标准品购买于Sigma-Aldrich公司；福林酚试剂、水溶性维生素E(Trolox)购买于默克公司；60%乙醇、5% NaNO2、10% Al(NO3)3、4% NaOH、20% NaCO3、甲醇、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、FeCl3、FeSO4·7H2O、乙酸钠、冰醋酸、浓盐酸、过硫酸钾、无水乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计(UV-5100BPC型，上海元析仪器有限公司)；电子天平(型号 AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；恒温水浴锅(HH-4型，金坛市科仪仪器有限公司)；高速台式离心机(TGL-20B型，上海安亭科学仪器厂)；高速多功能粉碎机(Q-250B3型，上海冰都电器有限公司)；低温冷却液循环泵(DLSB-5L/10型，巩义市予华仪器有限责任公司)，真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司)；旋转蒸发仪(Hei-VAP型，德国Heidolph)；电热鼓风干燥箱(WGL-125B，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 锦鸡儿花及根不同极性样品的制备 取锦鸡儿花及根粗粉各400g，加入85%乙醇回流提取3次，提取液浓缩得浸膏。将所得浸膏分散于水中，依次加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇溶剂各萃取3次，得到锦鸡儿花及根的氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相的萃取液，减压蒸发得各萃取相样品浸膏，备用。

1.3.2 总多酚含量的测定 采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)比色法测定各样品的总多酚(total phenolic content，TPC)含量。取0.6 mL不同浓度的样品，加入0.4 mL去离子水及0.5 mL福林酚试剂，充分摇匀，静置1 min；加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液及去离子水定容至10.0 mL，摇匀，于70℃水浴加热10 min，冷却后于765 nm下测定吸光值。在同样条件下使用不同浓度没食子酸标准溶液(0.5 mg/mL)制备标准曲线，计算锦鸡儿不同极性部位总多酚含量，将其表示为每1 g 提取物的没食子酸当量 ( mg GAE/g 提取物) 。

1.3.3 总黄酮含量的测定 吸取样品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，加入3.8 mL 60 %乙醇和0.3 mL 5% NaNO2，充分摇匀，静置8 min，加入0.3 mL 10 % Al(NO3)3和4.0 mL 4% NaOH溶液，用60 %乙醇定容至10 mL。静置12 min，于510 nm处测定吸光度。在同样条件下使用不同浓度芦丁标准溶液(0.5 mg/mL)制备标准曲线，计算锦鸡儿不同极性部位总黄酮含量，将其表示为每1 g 提取物的芦丁当量 ( mg RU/g 提取物) 。

1.3.4 抗氧化活性的测定 清除自由基即可阻断氧化反应，用DPPH法、Fe3+还原法、ABTS法测定锦鸡儿花及根各组分清除自由基的能力。用抑制率(K)表示清除自由基的能力大小，抑制率越大，清除自由基的能力越强，即抗氧化性越强。

(1)锦鸡儿花及根中不同极性萃取物对DPPH自由基的清除能力。参照文镜等[16]测定DPPH·自由基清除能力的方法和原理。精确称取DPPH 3.94 mg，用甲醇定容至10 mL，配成1 mmol/L的DPPH母液，测定时，用甲醇稀释10倍，配成0.1 mmol/L的DPPH反应液。取样品0.5 mL(稀释为一定浓度梯度的样液)于5 mL离心管中，加入2 mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液混匀，暗处放置并不断震荡30 min，于517 nm处测定吸光值。使用公式 [A0- (AX- AX0)]/A0× 100%计算各样品的DPPH·自由基清除率,式中A0是空白对照组吸光值(0.5 mL甲醇+2 mLDPPH)，AX是样品吸光值(0.5 mL样液+2 mLDPPH)，AX0是样品对照组吸光值(0.5 mL样液+2 mL甲醇)。

(2)锦鸡儿花及根不同极性萃取物ABTS+清除能力的测定。参照Garzón G A等[17,18]测定ABTS+清除能力的方法和原理。预先配置ABTS+自由基储备液：将5 mL ABTS (7 mmol/L)与88 μL过硫酸钾(40 mmol/L)充分混匀后，室温下避光放置12～16 h。使用前，用无水乙醇将ABTS+自由基储备液进行稀释从而得到ABTS+自由基工作液，要求该工作液在30℃下，734 nm下吸光值为0. 70 ±0. 02(用无水乙醇调零)，将该工作液置于30℃下保存备用。测定时，取0. 5 mL不同浓度的样品溶液，加入4 mL ABTS+自由基工作液，混合均匀，于30℃水浴加热6 min，于30℃、734 nm条件下测其吸光值。使用公式 [A0- (A2- A1)] A0× 100% 计算各样品的ABTS+自由基清除率,式中A0是空白对照组吸光值(0.5 mL无水乙醇 + 4.0 mL ABTS+)，A2是样品吸光值(0.5 mL样品 +4.0 mL ABTS+)，A1是样品对照组吸光值(0.5 mL样品 + 4.0 mL无水乙醇)。用Trolox对照溶液制备标准曲线。

(3)锦鸡儿花及根不同极性萃取物的总还原能力的测定。铁离子还原能力的测定采用铁离子还原法(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)，预先配制FRAP工作液：将乙酸钠缓冲液(0.30 M、pH 3.6)、TPTZ(10 mM)和FeCl3(20 mM)按照体积比为10∶1∶1的比例混合均匀，于37℃下水浴备用。测定时，取0.5 mL不同浓度梯度样品溶液，加入4.5 mL预热的FRAP工作液，混合均匀后于37℃水浴加热10 min，于593 nm下测其吸光值。用FeSO4对照品溶液制备标准曲线。

2 数据统计分析

所有实验均重复测定3次，使用Origin2019软件对数据进行统计学分析及作图。所有实验结果的形式表示为：三组平行实验的平均值(n = 3)± 标准偏差(SD)，并通过单因素方差分析( one-way ANOVA) 对所有数据进行显著性分析，P<0. 05 认为具有显著性差异，IC50值和EC50值均用 SPSS Statistics25软件进行计算。

3 实验结果与分析

3.1 锦鸡儿花及根中总多酚、总黄酮含量

多酚、黄酮类化合物在自然界中分布广泛，并且都具有较强的抗氧化活性。两类化合物的极性范围较宽，可以从不同极性的溶剂中萃取得到。因此，从不同极性部位萃取得到的总多酚、总黄酮含量的种类和数量也会存在一定的差异。锦鸡儿及根中不同极性萃取部位的总多酚、总黄酮含量结果分别见表1、表2、图1、图2。

由表1、表2和图1可以得出，锦鸡儿花及根中均含有一定量的多酚类化合物，其多酚含量范围在76.60～564.94 mg/g。锦鸡儿花及根的不同极性溶剂提取物中，多酚含量均为氯仿提取物>乙醇粗提物>水相。锦鸡儿花及根中总黄酮含量范围在5.31～188.00mg/g。锦鸡儿花不同溶剂提取物中，总黄酮含量为氯仿提取物>乙酸乙酯提取物>水相。而根中总黄酮含量为乙酸乙酯提取物>乙醇粗提物>水相。

表1 锦鸡儿花各样品中总多酚、总黄酮的含量

表2 锦鸡儿根各样品中总多酚、总黄酮的含量

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3.2 抗氧化活性分析

3.2.1 锦鸡儿花及根提取物对DPPH·自由基清除作用的比较 清除DPPH·自由基的能力通常以50%清除率时的样品质量浓度(mg/mL)，即IC50值来衡量，IC50值越小，则表示样品的抗氧化活性越强。经不同溶剂萃取锦鸡儿花及根的DPPH·自由基清除活性结果见表3。

由表3和图3可以看出，锦鸡儿花及根不同提取物对DPPH·自由基均有一定的清除能力。锦鸡儿花不同极性提取物中，抗氧化活性强弱顺序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。锦鸡儿根不同极性提取物中，抗氧化活性强弱顺序：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>水部位。

表3 各样品清除DPPH·自由基的IC50值

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3.2.2 锦鸡儿花及根提取物对ABTS+自由基清除作用的比较 ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制，通过在最大吸收波长734 nm处检测吸光度的变化来评价自由基被清除的情况，从而评价试验样品抗氧化能力的大小[19]。经不同极性溶剂萃取锦鸡儿花及根的ABTS+自由基清除活性结果见表4，其抗氧化活性强弱也以 IC50值来表示。

由表4和图4可以看出锦鸡儿花及根不同提取物对ABTS+自由基均有一定的清除能力，且锦鸡儿根的乙酸乙酯提取部位对ABTS+自由基清除能力略高于阳性对照Vc。在花不同极性提取物中，抗氧化活性强弱顺序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。锦鸡儿根不同提取物中，抗氧化活性强弱顺序为：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位。

3.2.3 锦鸡儿花及根提取物对铁离子还原能力的比较 用EC50值来衡量样品铁离子还原能力的强弱，EC50值表示还原能力达到0.5 mmol/L FeSO4·7H2O时所对应的样品质量浓度(mg/mL)，EC50值越小则表示样品的还原能力越强，即抗氧化活性越高。经不同极性溶剂萃取锦鸡儿花及根的铁离子还原能力结果见表5。

表4 各样品清除ABTS+自由基的IC50值

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表5和图5可以看出，锦鸡儿花及根不同提取物对铁离子均有一定的还原能力，阳性对照组Vc的铁还原能力明显优于各萃取物。锦鸡儿花不同极性提取物中，抗氧化活性强弱顺序：正丁醇部位>氯仿部位>乙酸乙酯部位。锦鸡儿根不同极性提取物中，抗氧化活性强弱顺序：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位。

表5 各样品还原铁离子能力的EC50值

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3.3 锦鸡儿总酚、总黄酮与抗氧化能力的相关性

对各组分总多酚和总黄酮含量和3种抗氧化评价方法的IC50值和EC50值进行相关性分析，总多酚和总黄酮含量越高抗氧化能力越强所对应的IC50值和EC50值越小，故数据应为负。锦鸡儿总酚、总黄酮与抗氧化能力的相关性如表6、表7所示，结果显示，锦鸡儿花中氯仿部分总黄酮含量与ABTS+清除率呈显著正相关(p<0.05)；锦鸡儿根中乙醇粗提物的多酚含量与ABTS+清除率呈极显著正相关(p<0.01)，而黄酮含量与ABTS+清除率呈显著正相关(p<0.05)；锦鸡儿根中氯仿部分的黄酮含量与DPPH · 清除率呈显著正相关(p<0.05)，锦鸡儿根中水部分的黄酮含量与DPPH · 清除率呈极显著正相关(p<0.01)。

表6 锦鸡儿花各样品中总多酚、总黄酮含量与抗氧化能力的相关性

表7 锦鸡儿根各样品中总多酚、总黄酮含量与抗氧化能力的相关性

4 讨论

从以上实验结果可以得出，不管是在锦鸡儿花提取物中，还是在锦鸡儿根提取物中，氯仿部位的多酚含量都是最高的，尤其是在锦鸡儿根提取物中，氯仿部位的多酚含量达到(564.94±4.61)mg/g，是其粗提物的2.92倍。其中锦鸡儿根乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物的黄酮含量大于锦鸡儿花的黄酮含量，而氯仿、正丁醇、水提取物的黄酮含量均小于锦鸡儿花的黄酮含量。总的来说，总多酚含量是其黄酮含量的3.01～14.43倍左右，且极显著。在其抗氧化能力方面，对花和根的同一极性部位而言，锦鸡儿花乙酸乙酯、正丁醇、水部位清除DPPH·自由基的能力显著高于锦鸡儿根，而在氯仿提取物中，锦鸡儿根清除DPPH·自由基的能力高于锦鸡儿花。对锦鸡儿花和根的ABTS+自由基清除能力均是乙酸乙酯和正丁醇部位最好。锦鸡儿根氯仿、乙酸乙酯部位对铁离子的还原能力高于锦鸡儿花，而在正丁醇、乙醇粗提物和水部位，锦鸡儿花对铁离子的还原能力高于锦鸡儿根。因此，锦鸡儿不同极性提取部位均具有抗氧化活性。并将其总多酚，总黄酮含量进行相关性分析，多酚和黄酮类物质的含量对DPPH·自由基、ABTS+自由基和Fe3+还原能力清除率有一定的正相关性，但并不绝对，且普遍相关性不显著，表明这些组分中可能存在除黄酮和多酚以外的其他抗氧化活性成分。通常情况下用无水乙醇提取出来的黄酮、多酚以及蛋白质、多糖相对较少，其活性物质及提取物的生物活性可能存在差异，故结果会存在差异[20]。氯仿易挥发，易被氧化并且极性相对较小，提取率也小，故氯仿部位所含有效化学成分相对较少[21]，因此，可能导致结果不一致性，这可能与黄酮或多酚的结构以及取代类型有关。

锦鸡儿作为民间药材具有悠久的应用历史，锦鸡儿花及根以及锦鸡儿属其它植物在抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多方面显示出良好的治疗活性，具有较高的研究价值和应用前景[22]。Cui YY 等[23]从传统药用植物锦鸡儿中提取黄酮类化合物3,4-二羟基-8,9-亚甲二氧基-洋心果聚糖，也证实所得化合物具有较高的抗氧化活性。本次实验证实了锦鸡儿花的正丁醇和乙酸乙酯部位，根的乙酸乙酯部位具有作为天然氧化剂的可能性，这与王金梅等[24]研究结果相符；Khan AN等[25]从锦鸡儿乙酸乙酯可溶部位分离得到一种新的异黄酮化合物，并对其抗氧化活性进行了评价，结果表明该异黄酮化合物也是一种有效的抗氧化剂；Jin Q等[26]从锦鸡儿根乙酸乙酯水溶性提取物中分离得到了两种新的低聚二苯乙烯类化合物以及葡萄糖苷，并对其抗氧化活性进行了评价，发现具有有效的抗氧化活性。这使得锦鸡儿作为天然氧化剂的应用价值和经济价值得到了进一步的肯定。

目前针对锦鸡儿的研究，虽然得到了一些具有抗氧化能力的黄酮和低聚二苯乙烯类化合物，但利用这些化合物的全合成和结构修饰来实现天然抗氧化剂产业化生产及应用仍需要开展长期深入的工作。我们注意到，锦鸡儿的经济价值较高，也有大量的研究集中在其栽培技术上，规模化的种植和采集使得其方便易得，那么明确其不同部位的抗氧化能力，可为锦鸡儿的二次开发和产业化应用提供理论基础和科学依据。