清热八味丸质量标准研究*

刘学良，韩达斌，陈 鹏，年永琪，汪永明，王永晶，刘海青

（青海省药品审评核查中心，青海 西宁 810007）

蒙药清热八味丸由石膏、人工牛黄、胡黄连、红花等8 味药材制成，有清热解毒功效，主要用于炽热、血热、脏腑之热、肺热咳嗽、痰中带血、肝火肋痛的治疗。始载于《卫生部药品标准·蒙药分册》［1］，现行标准《国家食品药品监督管理局标准》中，检验项目有显微鉴别、理化鉴别及胆酸的含量测定。为了更全面控制该制剂质量，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对方中人工牛黄、红花进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱（HPLC）法对方中胡黄连的有效成分胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ进行含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 1525型高效液相色谱仪，包含Waters 2489型紫外检测器、Empower 化学工作站（美国Waters 公司）；AB204-S型、ME204E型、XS105DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Lambda 35 型紫外 - 可见分光光度计（美国PE 公司）；硅胶H，G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药

清热八味丸（内蒙古蒙药股份有限公司，批号分别为 090424，090614，100217，100526，101022，101212，111214）；胡黄连苷Ⅰ对照品（国家标准物质中心，批号为MUST - 11062102，含量98%）；胡黄连苷Ⅱ对照品（批号为111596 - 201805，含量93.2%），胆酸对照品（批号为110775-201105，含量98.9%），猪去氧胆酸对照品（批号为110749-201316，含量99.7%），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、磷酸、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 人工牛黄［2-5］

取样品适量，研细，称取粉末0.5 g，精密称定，加乙醇10 mL，振摇15 min，离心，取上清液，作为供试品溶液。取猪去氧胆酸对照品、胆酸对照品各适量，分别加乙醇制成每1 mL 含2 种成分1 mg 的单一对照品溶液。按清热八味丸处方和工艺制备缺人工牛黄的阴性样品，并按供试品溶液方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则 0502 TLC 法，精密吸取上述溶液各5µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯 - 正己烷 - 甲醇 - 冰醋酸（8∶1.5∶0.25∶0.25，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，且阴性对照无干扰。详见图1。

图1 人工牛黄薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram of Bovis Calculus Artifatus

2.1.2 红花［6-10］

取样品适量，研细，称取粉末4 g，精密称定，加80%丙酮溶液 20 mL，振摇 15 min，静置 10 min 后，取上清液，作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按清热八味丸处方和工艺制备缺红花的阴性样品，并按供试品溶液方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法，精密吸取上述溶液各10µL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-水-甲酸-甲醇（7∶3∶2∶0.4，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置日光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色主斑点，且阴性对照无干扰。详见图2。

图2 红花薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of Carthami Flos

2.2 胡黄连苷含量测定［11-17］

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil - ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～7 min 时 22%A→17%A，7～14 min 时 17%A，14～15 min 时 17%A→19%A，15～30 min 时 19%A→20%A，30～45 min时20%A→22%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：266 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2.2 溶液制备

取胡黄连苷Ⅰ对照品10.86 mg、胡黄连苷Ⅱ对照品11.70 mg，精密称定，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，摇匀，即得胡黄连苷Ⅰ，Ⅱ质量浓度分别为0.212 9，0.218 0 mg/ mL 的单一对照品溶液。各取4 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得胡黄连苷Ⅰ，Ⅱ质量浓度分别为0.0425 8，0.0436 0 mg/mL的混合对照品溶液。取样品（批号100217）适量，研细，取1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率50 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按清热八味丸处方工艺制备缺胡黄连的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10µL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果待测成分与样品中其他成分分离良好，理论板数按胡黄连苷Ⅱ峰计应不低于3 000，阴性对照品溶液在与对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图3。

图3 高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液1，2，4，8，12，20 µL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，µg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，胡黄连苷Ⅰ为Y1= 1 738 693X1+ 9 175（r= 0.999 8），胡黄连苷Ⅱ为Y2=1 286 879X2+1 344（r=0.999 7）。结果表明，胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ进样量分别在0.042 58～0.851 6µg和0.043 60～0.872 0 µg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液10µL，按2.2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ峰面积的RSD分别为0.65%和0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2项下供试品溶液10µL，室温下按2.2.1 项下色谱条件分别于第0，3，6，12，18，24 h进样测定，记录峰面积。结果胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ峰面积的RSD分别为1.22%和1.06%（n= 6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号100217）适量，精密称定，共5 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ的平均含量分别为1.049 0 mg/g和1.722 4 mg/g，RSD分别为1.12%和0.86%（n=5），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：称取样品（批号100217）适量，研细，精密称定，共6 份，分别精密加入2.2.2 项下胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ单一对照品溶液，各适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取7 批样品各适量，分别按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of picroside Ⅰand picroside Ⅱ in samples（n=3）

3 讨论

清热八味丸方中，人工牛黄可清热解毒、化痰定惊［18］，红花可活血通经、散瘀止痛［19］，胡黄连可清热燥湿、泻火解毒、通经利尿，且胡黄连中胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ是其主要活性成分，具有较好的清热、杀菌及利尿作用［20］，与清热八味丸清热解毒功效一致。本研究中基于预试验中对提取溶剂、提取方法、提取时间等因素进行的考察，建立了清热八味丸方中人工牛黄、红花的TLC鉴别方法，胡黄连中胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ的HPLC 定量检测方法，可为今后研究清热八味丸质量标准提供依据。

含量测定预试验中，参考相关文献，同时结合胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ对照品溶液的紫外光谱扫描结果，选择紫外检测波长为266 nm。同时分别对甲醇- 0.10%冰醋酸溶液、甲醇-0.15%磷酸溶液、乙腈-0.15%磷酸溶液3种流动相进行考察，结果以乙腈-0.15%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时基线较平稳，对待测组分峰无干扰，故选择。

清热八味丸方中八味药材处方量相同，均为药材原粉入药制成水丸，胡黄连占处方总量的12.5%，2020 年版《中国药典（一部）》中规定，胡黄连中胡黄连苷Ⅰ与胡黄连苷Ⅱ的总量不得少于9.0%［21］，原粉入药转移率按90%计算，得样品中两者总量的理论值下限为10.125 0 mg/ g，而本研究中7 批样品的含量为2.718 2～3.842 2 mg/g，明显低于理论值下限。分析原因，清热八味丸现行质量标准中未对胡黄连进行控制，企业在生产过程中可能存在以次充好或投料不足的情况。

清热八味丸与清热八味散、清热八味胶囊均收载于《卫生部药品标准·蒙药分册》，药味相同，处方量略有差异，但清热八味系列3种制剂的质量标准控制项目差异较大，部分项目制定的控制指标不尽合理。2020 年版《中国药典》中对胡黄连苷Ⅰ和Ⅱ的含量进行控制，然而，清热八味胶囊现行标准中仅以肉桂酸的含量作为质量控制指标，不合理，也缺少代表性。后续制订的控制指标要考虑与其功能主治紧密结合，可考虑同时对3 种剂型的清热八味制剂进行研究，尽量建立较统一、完善的质量标准。