异甘草酸镁对酒精性肝损伤模型大鼠的影响*

王丹丹，乔 进，赵 彦

（南通大学附属南通第三医院，江苏 南通 226006）

当前，全球每年约255 万人由于长期饮酒导致死亡，约20%长期饮酒酗酒人群患有酒精性肝病（ALD），ALD 主要表现为肝脏细胞的损伤、坏死及凋亡［1］。临床治疗ALD 的传统方案包括使用糖皮质激素或肿瘤坏死因子 - α 抑制剂［2］，由于上述药物的免疫抑制作用，使用后常会增加感染风险。异甘草酸镁属镁盐，具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒作用和保肝活性，临床主要用于治疗炎性肝脏疾病［3］，用于治疗药物性肝损伤、免疫介导的肝损伤、脂肪肝时也有肝保护作用［4-6］。有研究显示，异甘草酸镁可减少乙醇在体外诱导的脂质积累［7］，但其在体内有效治疗ALD 的机制尚未明晰［8］。本研究中探讨了异甘草酸镁对酒精性肝损伤模型大鼠的肝脏保护作用是否与减轻肝细胞氧化应激损伤及抑制中性粒细胞浸润有关。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：BH - NIC - B 型倒置光学显微镜（日本Olympus 公司）；722 型分光光度计（上海分析仪器厂）；Yil - 16G 型低温离心机、TDL - 50B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-S2 型恒温水浴箱（河南金博仪器制造有限公司）。

试药：异甘草酸镁注射液（正大天晴药业集团股份有限公司，批号为200508104）；丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号为140118010）试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶（AST，批号为140218007）试剂盒，丙二醛（MDA，批号为20180326）试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD，批号为20180322）试剂盒，髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（批号为20191211），均购自南京建成生物工程研究所；β -actin 抗体（上海康成生物工程有限公司，批号为ab8226）；5-脂氧化酶（5-LO）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号为760700）；预染蛋白Marke（r美国New England Biolabs公司，批号为00686128）。

动物：清洁级SD 大鼠，10 周龄，雌雄各半，体质量160～180 g，购自南通大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（苏）2018-001，动物使用许可证号SYXK（苏）2018-0031。饲养期间自由饮水，饲喂普通维持饲料。饲养环境为昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度22～25 ℃。适应性喂养1周后开始实验。本研究中动物实验方案经实验动物伦理委员会批准，符合动物保护原则。

1.2 方法

1.2.1 复制模型与分组、给药

48只大鼠随机分为正常对照组（等体积生理盐水）、模型组（等体积生理盐水），以及异甘草酸镁低、高剂量组（15 mg / kg，45 mg / kg），各 12 只。第 1～2 周灌胃50%乙醇（8 mL/ kg），第3～8 周均灌胃50%乙醇（12 mL/kg），复制酒精性肝损伤大鼠模型，同时正常对照组灌胃等体积生理盐水。复制模型的同时，各组大鼠腹腔注射相应药物或生理盐水，每日1次，持续8周。

1.2.2 观察指标

一般情况：观察研究过程中各组大鼠的精神状态、生存情况等。

转氨酶水平：末次给药后禁食12 h，麻醉大鼠，腹主动脉取血，常规离心，取上清液，按试剂盒说明书测定大鼠血清中ALT及AST的水平。

MDA 及SOD 水平：末次给药后禁食12 h，处死大鼠，取肝组织，用生理盐水漂洗后吸干表面液体，置碎冰块上的玻璃皿中剪碎、匀浆，低温离心后取上清液，按试剂盒说明书测定大鼠肝组织匀浆中MDA 及SOD的水平。

肝组织病理形态学：取大鼠肝脏，苏木素- 伊红（HE）染色，石蜡切片，脱蜡，染色，在显微镜下观察大鼠肝组织病理形态学。

肝组织MPO 表达水平：采用免疫组化法。将大鼠肝组织切片、脱蜡，梯度乙醇入水，用柠檬酸缓冲液修复抗原，3%过氧化氢溶液灭活，MPO - 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，37 ℃复温，30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育 30 min，PBS 洗涤 3 次，DAB 显色，苏木素复染，透明，封片。采用JEDA801D 型形态学软件测定阳性信号的面积与平均灰度值。

5-LO蛋白水平：采用Western bloting法。取大鼠肝组织适量，加入RIPA蛋白裂解液，以BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE 电泳后电转，恒流300 mA 转膜150 min至PVDF 膜上；用含5%脱脂牛奶的TBST 室温封闭2 h，分别加入5 - LO 一抗与β - actin 抗体4 ℃摇床孵育过夜；TBST洗涤2次，再加相应二抗室温反应1 h，TBST洗涤2 次，加入ECL 化学发光试剂，X 线胶片曝光显影定影。通过Image J软件将条带灰度值数字化，计算各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件分析。计量资料以表示，行单因素方差分析或q检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

模型组大鼠灌胃乙醇，表现出反抗状态，灌胃后10 min，精神明显受到抑制，活动少。异甘草酸镁低、高剂量组大鼠上述症状较模型组显著减轻，活动增多。模型组大鼠在第6 周与第7 周分别死亡1 只，剩余10 只，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠未见死亡。

2.2 肝组织病理形态学

正常对照组大鼠的肝组织结构排列紧致，肝细胞大小均匀；模型组大鼠肝细胞之间有空泡，排列不齐，较紊乱，部分肝细胞变性坏死；异甘草酸镁低、高剂量组大鼠肝细胞的变性不同程度改善，炎性细胞浸润程度较模型组减轻。详见图1。

图1 大鼠肝组织病理形态学（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of liver tissue of rats（HE，× 200）

2.3 实验室检测指标

血清转氨酶：与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT 及AST 水平均显著升高（P ＜0.01）；与模型组大鼠比较，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠ALT 及AST 水平均显著降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。详见表1。

肝组织匀浆中MDA 及SOD：与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织匀浆中MDA 水平显著升高，SOD 水平显著降低（P ＜0.01）。与模型组比较，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠MDA 水平均显著降低，SOD 水平均显著升高（P ＜0.05或P ＜0.01）。详见表1。

表1 各组大鼠血清及肝组织匀浆中检测指标比较（）Tab.1 Comparison of serum ALT and AST levels of rats in each group（）

表1 各组大鼠血清及肝组织匀浆中检测指标比较（）Tab.1 Comparison of serum ALT and AST levels of rats in each group（）

注：与正常对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与模型组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.

组别正常对照组（n=12）模型组（n=10）异甘草酸镁低剂量组（n=12）异甘草酸镁高剂量组（n=12）5-LO 0.28±0.02 0.93±0.05*0.48±0.02#0.44±0.03#剂量（mg/kg）15 45 ALT（U/L）39.36±3.47 90.55±7.01**77.14±4.26#58.19±5.03##AST（U/L）85.31±6.95 164.24±12.36**122.77±9.81#93.66±7.12##MDA（nmol/L）2.17±0.14 9.58±0.31**7.04±0.24#4.97±0.22##SOD（U/mL）134.30±9.28 60.11±4.87**90.13±4.42#111.89±5.26##MPO 0.05±0.01 0.78±0.13**0.46±0.06#0.22±0.02##

肝组织匀浆中MPO 表达：正常对照组大鼠肝组织匀浆中MPO的阳性程度弱；与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织匀浆中MPO阳性表达水平显著升高（P ＜0.01）。与模型组比较，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠肝组织匀浆中MPO阳性表达水平均显著降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。详见表1及图2。

图2 大鼠肝组织匀浆中MPO表达水平（苏木素，×200）Fig.2 MPO expression levels in liver homogenate of rats（Hematoxylin，× 200）

肝组织匀浆中5 - LO 蛋白表达：与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织匀浆中5 - LO 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠肝组织匀浆中5-LO 蛋白表达水平均显著降低（P ＜0.05）。详见表1及图3。

图3 大鼠肝组织匀浆中5-LO蛋白表达水平Fig.3 5-LO protein expression levels in liver homogenate of rats

3 讨论

本研究中采用乙醇灌胃复制的大鼠肝损伤模型，对大鼠带来的病理与生理变化符合长期饮酒人群的生理与病理变化规律。该模型中，采用前2 周与后6 周同体积分数但不同剂量的乙醇灌胃，成功复制了大鼠模型。

ALT与AST均是肝损伤的敏感性指标，分别存在于肝脏细胞的细胞浆与线粒体内，当肝脏受到损伤时，两者均会从细胞内释放入血［9-11］。本研究中，模型组大鼠血清中ALT 及AST 水平均显著高于正常对照组，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠血清中ALT 及AST 水平均显著低于模型组；同时，模型组大鼠肝组织匀浆中MDA水平显著高于正常对照组，SOD 水平显著低于对照组，提示大鼠经乙醇灌胃，肝组织处于氧化应激损伤状态；异甘草酸镁低、高剂量组肝组织匀浆中MDA 水平较模型组显著降低，SOD 水平显著升高，提示异甘草酸镁能通过降低肝脏氧化应激损伤来减轻乙醇对肝脏的损害。

中性粒细胞浸润在肝组织病变中发挥了极大的损害作用，进一步加重了肝组织损伤［12-14］。模型大鼠肝脏中，大量浸润的中性粒细胞会进一步释放出炎性物质、细胞毒类物质来加重病理性伤害，进一步破坏肝功能，引起肝细胞损伤。MPO 在机体内由中性粒细胞等分泌，是中性粒细胞的标记物，其表达水平的高低可直接反映组织的炎症程度［15-16］。5-LO 在肝脏中一般参与白三烯、花生四烯酸等的催化反应，介导炎性反应的发生与发展，参与炎性反应的放大过程。有研究发现，5-LO加快了中性粒细胞生成白三烯B4的过程，白三烯B4则导致了炎症发生［17］。因此本研究中通过药物干预控制ALD 模型大鼠肝组织中5 - LO 的表达，观察能否抑制肝脏疾病的发病及进展。

本研究中，异甘草酸镁低、高剂量组大鼠肝细胞中炎性细胞的浸润程度较模型组显著减轻，免疫组化结果显示，大鼠肝组织匀浆中MPO 阳性表达水平及5 - LO 蛋白表达水平不同程度降低，提示不同剂量的异甘草酸镁对炎性反应的抑制程度不同。

综上所述，异甘草酸镁具有一定的肝脏保护作用，其机制可能与减轻肝细胞氧化应激损伤与抑制中性粒细胞浸润有关。