红阳猕猴桃致腐真菌的分离与鉴定①

李文欣, 朱德全,2*, 吴云飞, 张路路, 马 佳, 刘景林, 李 富

(1.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007 2.贵州民族大学,贵州 贵阳 550025)

0 引 言

猕猴桃属于多年生落叶木质藤本植物,研究价值较高,其中一优良品种为红阳猕猴桃,红阳猕猴桃属中华猕猴桃系[1],果皮为偏绿黄褐色,表面无毛,富含丰富的营养成分,但丰富的营养物质同时也为腐败微生物的滋生提供了良好条件。研究表明,猕猴桃中大多数病害是由于真菌侵染造成的,猕猴桃果实腐烂病主要包括软腐病、根腐病、青霉病、日灼病等[2],引起这些病害的主要微生物有灰霉菌(Botrytiscinerea)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、交链格孢菌(Alternariaalternata)[4]、间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)等,这些病原微生物都是从有伤部位侵入果实,借由伤口处不断侵害果实,引起水果发生腐烂等病症。腐烂的水果不但会形成不良性状,更失去了原有的味道与营养,在贮藏、保鲜等方面都会造成巨大影响,给该产品一系列产业链造成经济损失。那么,对猕猴桃水果中致病性真菌的鉴定需进行更深入研究。因此,本文以购买于四川蒲江镇水果园的红阳猕猴桃为主要原料,将红阳猕猴桃在室温下放置腐烂,取腐烂组织块进行培养,对腐烂的猕猴桃上的真菌进行了分离纯化,并通过形态学与分子生物学的方法对造成猕猴桃果实腐败的主要致病菌进行了识别与鉴定,有望为进一步深入研究致腐微生物及其对红阳猕猴桃水果病害的致病机理,及其贮藏保鲜技术提供了重要依据。

1 材料与方法

1.1 仪 器

本文使用仪器见表1:

表1 仪器设备

1.2 方 法

采用常规的组织分离法,全程在超净工作台无菌环境中进行操作,将实验用的红阳猕猴桃先用清水简单冲洗、晾干,然后置于室温下放置一段时间,待水果开始腐烂时,开始进行组织分离,选取腐烂当天,48h,96h等多个时间段对果实腐烂部位进行操作,将腐烂的水果用浓度为75%的酒精中浸泡的酒精棉擦拭水果表面,然后放在超净台中通风吹干,吹干后的果子用无菌的手术刀从果实腐烂部位开始切割,从腐烂的部位切成小块,切取的腐烂组织,将其置于真菌培养基中,每个培养皿中以近似于等边三角形形状放入三个组织块,将接入组织块的平板倒置在恒温培养箱中进行培养。每天进行观察,当观察到平板中出现菌群时,可将肉眼观察到的不同菌落都转移到新配制的对应真菌培养基中,每板接出2-3个重复组,不断进行纯化,最终获得纯种的真菌,将得到的纯种真菌接入液体培养基中进行培养,培养至对数期后,将其与浓度为30%的甘油以等比例制成甘油培养基,放入-80℃冰箱中保存备用。

对分离纯化出的全部真菌进行致病性检测,将新购置的猕猴桃用自来水进行简单清洗,再将清洗后的猕猴桃浸入到浓度为75%的酒精中浸泡片刻,捞起后用用蒸馏水进行多次冲洗,将分离得到的真菌菌饼用无菌打孔器打出圆饼,在猕猴桃表皮切开菌饼大小的伤口,将菌饼用无菌镊子夹取至伤口处,同时设置三组重复,一组对照,对照组需将无菌PDA培养基打成菌饼放置于伤口处,将操作后的果子放在室温下进行培养,培养过程中注意对水果进行保湿,每天对果实进行观察、拍照与记录,最终通过比较对照组与实验组出现的现象,分析确定致腐菌。

得到致腐菌后,要对致腐菌进行形态学及分子生物学鉴定,将纯化的致腐菌接种在新鲜的PDA培养基中,并放入28℃恒温箱中进行培养,于接种后的3,5,7d内对致腐菌菌落进行形态学鉴定,按照国内传统的真菌鉴别方式,最终确定致腐真菌的类型。依照真菌DNA提取试剂盒操作说明提取待测致腐菌株DNA对目标菌株DNA进行扩增。设置适宜PCR仪器参数,加入适当试剂,轻弹混匀,离心收集离心管壁上的液滴,调整PCR扩增仪上的反应参数进行PCR反应,反应完成后,将提取出来的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒回收,将提取出的DNA物质送到上海派森诺生物科技公司进行检测,结果可以与NCBI数据库中的生物数据进行比对,与待测的生物序列中接近程度最大的生物信息,就是鉴定的结果[3]。

2 实验过程

购置红阳猕猴桃果实在室温下放置15天左右,开始逐一出现腐烂症状,最开始果实表皮会出现褶皱,果实开始软化,慢慢,时间越久,果皮就会出现褐色腐烂斑块,且以伤口为中心向四周不断扩大,病斑直径逐渐增大,直到部分果实出现膨胀现象,有些会从病斑中心流出褐红色的汁液,有些会在腐烂部位出现白色泡沫状液体,同时,在后期观察时也会闻到一些酒精的味道。本实验对不同时期腐烂的红阳猕猴桃进行致腐菌的分离,分离猕猴桃果实各个部分。将采购的红阳猕猴桃表皮进行清洗,再用酒精擦拭1遍后用清水冲洗2-3次,待猕猴桃开始腐烂,选取各个腐烂天数的猕猴桃,在超净台中切取果实腐烂的各个部位,放真菌培养基中,将挑取果肉组织的平板倒置放在恒温培养箱中进行培养,多次纯化后得到3株真菌,分别命名为Q1,Q4,Q5。

采用有伤接种法,按前面所示实验方法将分离出来的3株真菌用打孔器制成菌饼,将菌饼接种在消毒、冲洗、风干后的红阳猕猴桃上,菌饼上的致腐菌可借助伤口迅速侵入到果实的内部,将接种好的猕猴桃放在28℃培养箱中进行培养,期间注意保持猕猴桃的湿度,不至于干瘪影响观察结果,每隔两天做一次观察和记录,拍照保存,观察结果如下:回接8-9天后发现,3株菌株中只有2株对果实有致腐作用侵染的果实会从侵染部位向四周发生褐变,随时间增长,以伤口为直径向四周扩散,伤口部位四周变软,向内凹陷,并伴有腐烂臭味出现(见图1、2);其他侵染实验及对照组均不发病。

图1 Q4

根据观察得出接入致腐菌Q4菌饼的猕猴桃出现中间凹陷,围绕伤口处出现大面积褐色腐斑,对照组表面仅出现轻微皱缩;接入致腐菌Q5菌饼的猕猴桃出现中间凹陷,围绕伤口处出现大面积褐色腐斑,其中一个果实流出黄褐色汁液,伴有酒精气味,对照组表面仅出现轻微皱缩。由观察结果和记录结果最终确认本次实验分离出的真菌中有2株对红阳猕猴桃有致腐作用,需对这2种致腐真菌Q4,Q5进行形态学和分子生物学层面的鉴定,确认2种致腐菌归属。

对2种致腐菌进行形态学鉴定,致腐菌Q4培养至第5天,菌落直径为7.3cm,初期为白色,后期菌落底部颜色加深,从绿色到墨绿色到黑绿色,向四周扩散,气生菌丝极其浓密且长,菌丝为灰白色,依据致腐菌的形态特征可初步将其鉴定为葡萄座腔菌(Botryosphaeria);致腐菌Q5培养至第5天,菌落直径为7.3cm,初期为白色,菌饼为绿色并向四周扩散,后期菌落背面开始变为黑色,气生菌丝长,菌丝为灰白色,簇状生长。依据致腐菌的形态特征可初步将其鉴定为葡萄座腔菌(Botryosphaeria)。

对2种致腐菌进行分子生物学鉴定,从编号为Q4,Q5菌株中提取DNA,对提出的DNA进行PCR扩增,取各个菌种的PCR产物,使用PCR测序仪对致腐真菌进行扩增。扩增结果在数据库中进行比对,观察与待测物种相似度最高的物种信息得知,致腐菌Q4位于葡萄座腔菌(Botryosphaeria)分支,为Botryosphaeria dothidea;致腐菌Q5位于葡萄座腔菌(Botryosphaeria)分支,为Botryosphaeria dothidea;以上提取的产物与比对序列的相似率均达百分之九十九之上。结合两种鉴定方法,可知此次分离得到的致腐真菌中,红阳 猕猴桃果实的致腐病原真菌主要葡萄座腔菌。

图2 Q5

3 结 语

马纯珏等对新西兰进境猕猴桃进行研究,分离到狭截盘多毛孢菌(Truncatella angustata);张国辉等对黔东南州红心猕猴桃进行研究,分离到尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)和互隔交链孢霉(Alternaria alternata);王瑞玲等对红阳猕猴桃进行研究,从采摘后的猕猴桃中发现了2种致腐菌,分别是尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria parva)。

1.本次实验选取购于四川蒲江县的红阳猕猴桃,放置至腐烂后,从中分离纯化得到3株真菌,分别为Q,Q4,Q5。

2.其中,经致腐性鉴定得出,菌株Q4,Q5侵染后的果实会从侵染部位开始发生褐变,果实逐渐变软,并伴有腐烂的臭味出现,其他侵染实验及对照组均不发病,共计致腐菌株2株。对2株致腐菌进行形态学与分子学鉴定,得知致腐菌致腐菌Q4,Q5同位于葡萄座腔菌(Botryosphaeria)分支,为Botryosphaeria dothidea;以上提取的产物与数据库进行比对的序列结果,相似度分别达到了99%以上,其中Q4(Botryosphaeria dothidea)的相似度达到了100.00%;Q5(Botryosphaeria dothidea)的相似度达到了99.81%。

3.此次分离最后得到的致腐真菌菌株中,主要为葡萄座腔菌。下一步会进行其他致病菌的检测与鉴定,以期寻找到有效对抗致腐菌的生防菌株,为红阳猕猴桃的保鲜提供更多支持。