FFPE组织HPV检测技术的研究进展

王 诚 综述，况 薇 审校

四川大学华西第二医院病理科/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川成都 610000

宫颈癌是威胁女性生命健康最主要的恶性肿瘤，其主要致癌因素是持续性人乳头瘤病毒(HPV)感染[1]。我国女性高危型HPV(HR-HPV)感染率为19%，与全球其他地区基本一致，感染率位于前5的HPV型别分别为16、52、58、53、18型[2]。HPV检测是宫颈癌筛查的重要手段，国内已有一百余种HPV核酸检测试剂盒，其均主要适用于宫颈脱落细胞标本[3]。然而，当新鲜标本无法检测或用于回顾性流行病学研究时，需使用活检组织标本替代。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织是生物标本最常见的保存形式，可常年存放于病理档案室。FFPE组织经过一定的物理和化学处理，使细胞形态、组织结构保持稳定的同时，核酸和蛋白质亦不会受到较大的破坏，为分子病理检测、基因分析和流行病学研究等提供了更广泛的标本来源。但甲醛及石蜡等化学试剂可造成组织不同程度的DNA片段化及DNA、蛋白质相互交联，对DNA提取产量和PCR扩增效率均产生不良影响[4]。目前，用于FFPE组织中的HPV检测技术缺乏共识和规范，本文围绕组织标本的获取、固定和保存等方面，归纳了可能影响核酸质量的因素，并对FFPE组织的核酸提取制备及HPV检测方法进行综述。

1 影响核酸质量的因素

1.1组织获取 固定前合理的组织获取方式可更好地保证标本中核酸及蛋白质的质量。组织器官的冷缺血时间、标本大小、脱钙方法等均影响后续FFPE组织标本的核酸分析。有研究发现，冷缺血时间控制在24 h内不影响PCR扩增成功率，但冷缺血时间超过24 h，其荧光原位杂交信号强度会明显减弱[5]。另外，组织标本体积不宜过大，3～10 mm3大小的组织经固定后核酸质量保存较好，PCR扩增成功率最高。有学者研究发现，脱钙方法的不同会直接影响核酸质量，乙二胺四乙酸(EDTA)和超声脱钙法均优于酸性脱钙液法，前者标本进行RT-PCR检测可扩增出更长的片段，同时在荧光检测方面，经甲酸脱钙后荧光信号强度欠佳[6]。因此，根据研究者检测需求选择相应的组织获取手段，以保证组织内核酸质量少受或不受影响。

1.2组织固定 固定液的pH值、固定时间和温度都是影响FFPE组织核酸质量的决定性因素，影响PCR扩增能否成功。既往研究发现，中性福尔马林固定效果较好，对核酸片段化破坏小，且固定时间在48 h内获取的DNA完整性和产量更高，用于PCR、原位杂交和单核苷酸多态性检测时的成功率最高；反之，延长固定时间(≥48 h)，则影响RNA相关的检测[7]。因此，生物标本分析前组织固定程序标准化至关重要，在某些类型的肿瘤标本中，DNA和RNA的质量可能受到延迟固定或固定时间的影响。通常，福尔马林固定时间的延长(超过18～24 h)引起RNA片段化及核酸修饰会干扰cDNA的合成，从而获得低质量的qPCR数据。此外，对于标本固定的温度仍有一定争议，有研究表明，福尔马林在4 ℃下固定可以保留FFPE组织标本中DNA的完整性，与常温下固定的FFPE组织标本相比，前者获得的DNA碎片化程度明显降低[8]。

1.3组织的处理及保存 组织标本的脱水、透明和浸蜡过程也影响着核酸质量，高纯度石蜡在PCR扩增中具有明显优势。此外，FFPE组织标本的保存与核酸质量密切相关。有研究将保存了数十年的浸润性宫颈癌FFPE组织标本用于HPV16 L1基因与人类微管蛋白-β检测，结果发现，保存时间≤15年的标本均成功扩增出病毒基因和管家基因，但保存时间>15年的标本扩增出更长靶基因的能力显著下降[9]。有研究者将保存时间为5～21年的FFPE组织标本用于提取RNA，结果发现保存时间对mRNA、microRNA和rRNA扩增水平并无太大影响，但其中保存时间≤1年的FFPE组织标本获得的RNA完整性最佳[10]。所以，FFPE组织标本保存时间的延长会不同程度影响病毒基因和管家基因的PCR扩增。影响FFPE组织核酸质量的因素见表1。

2 核酸的提取

2.1提取步骤 一般而言，FFPE组织核酸提取需4个步骤：切片、脱蜡、蛋白酶消化和纯化。操作前，用70%～75%乙醇擦拭切片机以减少污染；切片常采用“三明治”技术，厚度根据试剂及组织大小而定，通常推荐10 μm切片；一个刀口对应一个蜡块；若操作中发现疑似污染应及时更换手套，尽可能使用一次性镊子或牙签转移切片[11]。值得注意的是，由于组织表面暴露于空气中发生的氧化反应，前2～3张切片建议丢弃，并推荐切片后1 h内进行核酸提取，或存放于4 ℃待测。脱蜡最常用的试剂为二甲苯，但其具有一定毒性，且有机溶剂的反复处理等可增加组织丢失的风险。另外，由于有机溶剂脱蜡操作比较耗时，有学者通过直接加入自配蛋白酶裂解液(蛋白酶K、EDTA、0.5%吐温、50 mmol Tris)后，100 ℃热处理10 min，15 000×g 4 ℃离心，同样能获得足量核酸，并成功扩增HPV L1基因片段[12]。现对于FFPE组织标本核酸提取后是否需要纯化尚存有争议，而大多研究集中应用QIAamp®DNA FFPE Tissue纯化试剂盒。

2.2核酸质量的验证 人类管家基因是用于验证DNA质量的关键指标，如β-Globin或β-actin。由于福尔马林固定等因素引起DNA碎片化会降低PCR扩增效率，因此，在FFPE组织中容易扩增小片段靶标，一般控制在65～270 bp为宜，每25 μL扩增反应体系需标本量1～10 μL。有研究发现，粗提试剂所获得的基因组DNA与FFPE组织纯化提取试剂相比，HPV PCR扩增结果无明显差异[13]。因此，FFPE组织标本核酸提取方法的异同对HPV L1基因扩增的影响甚微。也有学者通过对比QIAamp®DNA FFPE Tissue、EX-WAXTMDNA和ReliaPrepTMFFPE gDNA 3种提取试剂盒检测HPV16感染情况，发现21例头颈部癌患者感染率分别为38.1%、33.3%、33.3%[14]。因此，QIAamp®DNA FFPE Tissue纯化试剂盒可检测出更多HPV感染病例。由于PCR扩增检测HPV L1的靶标长度为65～700 bp，FFPE组织标本对于小片段病毒基因扩增更敏感，可能无法检出大片段病毒基因亚型。FFPE组织核酸提取的主要试剂盒、方法及HPV检测平台见表2。

表1 影响FFPE组织核酸质量的因素

表2 核酸提取的主要试剂盒、方法及HPV检测平台

3 HPV检测技术

3.1HPV特点 HPV是一种小分子双链环状DNA病毒，长度约8 000 bp，呈二十面体对称性，无包膜，直径为45～55 nm。其核酸按功能主要分为早期编码区、晚期编码区和非编码区，其中晚期编码区分为L1、L2，早期编码区分为E1、E2、E4、E5、E6和E7，具有病毒复制、转录调控和细胞转化等功能。E1、E2均与病毒复制有关，也常作为病毒整合位点。E6、E7是大多数HPV亚型的转录起始点，可分别与抑癌基因p53、pRb结合并导致其失活引起宫颈癌的发生。HPV有多种亚型，根据其致癌能力，分为低危型HPV(LR-HPV)和HR-HPV，LR-HPV一般与皮肤病变有关，HR-HPV与黏膜病变有关。HPV具有严格的宿主和组织特异性，主要感染人的皮肤或黏膜上皮细胞，初次感染HPV大部分可治愈，与病毒的侵袭能力和感染者免疫状态相关，持续反复的HR-HPV感染可能使病毒DNA整合至宿主基因组中，破坏自身基因组和宿主染色体结构，进而导致癌基因激活，引起癌症的发生[15]。

3.2PCR检测技术 PCR检测技术是HPV DNA检测的传统方法。目前，大多数商品化HPV DNA PCR检测技术针对宫颈脱落细胞或分泌物，而组织标本的HPV DNA检测缺乏合适的检测方法。HPV L1基因区高度保守，并在不同亚型中的突变频率均较低，其靶向扩增片段为65～450 bp。FFPE组织标本制备过程复杂，可能导致广泛的DNA损伤，包括交联和断裂，并可能降低检测的准确性。目前，针对L1基因区常见的通用引物分为3类，包括MY09/11、GP5+/GP6+和SPF10(INNO-LiPA)，其靶标片段大小分别为450 bp、65 bp和150 bp[16-18]。一项最新的多中心回顾性研究评估了HPV相关肿瘤的基因型分布，HPV DNA和分型检测使用SPF-10/LiPA25系统，对来自50个国家或地区18 247份FFPE组织标本进行检测，发现在有效实施HPV疫苗接种计划的国家或地区约90%的宫颈癌和50%的HPV相关癌症的发生被有效预防[19]。SPF-10的扩增效率高于其他通用引物，可能是由于扩增靶区较小，扩增效率较高。同样，有研究通过对比宫颈脱落细胞与FFPE组织标本的HPV感染情况，发现Onclarity荧光PCR与SPF-10检测HPV感染的总体一致性较好(Kappa=0.82)，但对某些基因型的检测结果存在一定差异[20]。此外，FFPE组织DNA提取过程中容易造成标本交叉污染，应按组织核酸提取标准操作规程进行操作，以减小污染的风险；同时，也可以设置内参以减少HPV DNA假阳性的发生。

3.3原位杂交(ISH) ISH是一种将特定标记的已知序列核酸作为探针与组织细胞中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法，能显示病毒整合到染色体上的分布情况及具体位置。荧光信号标记的核酸探针特异性识别肿瘤病灶HPV DNA/RNA，其优势在于成本较低，但灵敏度与特异度取决于探针的类型。当杂交信号在细胞核内为点状密集分布时为整合状态，点状信号和弥散信号共存时为游离状态与整合状态的混合。然而，有研究发现，ISH产生的高强度背景信号会干扰目标DNA信号，造成假阴性结果，并且DNA ISH检测技术的灵敏度明显低于RNA ISH检测技术[21]。HPV E6和E7癌蛋白检测是判断病毒活化情况的“金标准”。近年来，采用RNAscope方法检测FFPE组织标本中18种HR-HPV和6种LR-HPV E6/E7被证实具有较高的特异度、灵敏度及稳定性。RNAscope使用特有探针和单分子水平检测技术来检测靶mRNA分子，并区分基因亚型，其独特的“双Z”寡核苷酸探针设计可高度特异性地在FFPE组织中检测到每个HPV亚型转录的E6/E7 mRNA[22]。有学者研究发现，HR-HPV E6/E7 mRNA ISH检测技术在宫颈病变组织中呈不同的染色模式，可能呈现弥散染色核信号(CIN Ⅰ)到整个上皮多点状细胞质及核信号(CIN Ⅲ)，此现象与HPV感染机制基本相符，可用于辅助宫颈病变的诊断[23]。因此，RNA ISH检测技术能检测出活化的HPV，并将活性病毒在肿瘤组织中的转录动态可视化，但缺点在于其成本较高且无法确定具体型别。

3.4其他方法 免疫组织化学p16染色是最简单、经济的HPV感染检测替代标记物，应用广泛，易于操作，高度敏感。另外，p16染色的优势在于标本DNA的降解对结果不会产生明显影响，对HPV相关口咽鳞状细胞癌的诊断特异度高达80%[24]。随着现代分子诊断学方法的不断发展，新技术逐渐被广泛应用于FFPE组织的HPV检测，如多重实时荧光PCR技术、多重连接依赖式探针扩增技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法、杂交捕获法和测序技术等[25-27]。

4 小 结

随着对检测技术研究的不断深入，HPV疫苗已成为当前研究热点，其主要分为两种：预防性疫苗和治疗性疫苗，前者以晚期编码区L1/L2作为靶抗原，在细胞表面完成自我组装形成病毒样颗粒，通过诱导机体产生特异性中和抗体及免疫反应，防止机体受到HPV感染。早期编码区E6/E7靶抗原是HPV感染相关疾病理想的治疗性疫苗，但其免疫机制复杂，仍在探索中。持续性HR-HPV感染是宫颈癌发生的先决条件，及时、准确的HPV检测是早期诊治与预防宫颈癌的关键。FFPE组织的HPV检测受到多种因素的影响，包括组织的获取、核酸的提取及检测方法的选择等方面。PCR技术是目前检测病毒的有效手段之一，其限制因素较少，适合新鲜组织标本及FFPE组织标本。SPF-10 PCR体系扩增效率最佳，被广泛应用于各类FFPE组织的检测。RNA ISH检测技术不仅可以定位单个细胞病毒的整合位点，还能检测到低病毒载量的细胞，是目前FFPE组织HPV检测的“金标准”。随着分子诊断技术的不断发展，HPV检测方法逐渐呈现多元化，病理实验室可根据诊断需要选择合适的检测方法，为临床诊疗工作提供最有效的帮助。