三色堇对NaCl 胁迫的生理响应

苏世平，刘小娥，席杰

（甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070）

土壤盐渍化是全球面临的环境问题，由于在农业生产中长期的灌溉行为，导致盐分随灌溉水进入土壤，另外由于不合理的灌溉，导致过多的水分渗入土壤深层，在土壤水分蒸发的过程中，将深层土壤中残存的盐分通过土壤毛管蒸发作用运移到土壤表层，加剧了土壤盐渍化。有研究表明，全球现有盐碱地10 亿hm2［1-2］，并以每年100万～150 万hm2的速度增长，而我国是盐碱化土地重灾国，据报道，全国目前有盐渍化土地面积为3600 万hm2，占全球盐碱地面积的3.6%，占全国可耕地面积的4.88%［2-3］。因此，随着盐碱化土地面积和盐碱化程度的加剧，一方面将导致农业可耕土地面积的减少，另一方面，将使盐碱地上生长的植物受到更强的盐碱胁迫，影响植物的正常生命活动。NaCl 是土壤中最常见的中性盐，对植物的胁迫主要以Na+和Cl-胁迫为主，Cl 是植物生长的营养元素之一，在植物体内主要以离子形态存在，参与光合作用光系统Ⅱ中水的光解放氧反应，还能提高细胞的渗透压和植物组织的水合作用，具有一定的生理功能，但是植物对Cl-的需要量较少，当Cl-过多时会造成离子毒害，抑制植物生长［4-5］。而Na 元素不是植物生长所必需的元素，土壤中Na 元素的存在，会对植物造成离子伤害，是因为Na+会取代细胞膜上的Ca2+，导致细胞膜出现漏洞，细胞内原生质体外渗，进而引起离子种类和离子浓度发生改变，Na+胁迫也会造成叶绿体破坏，使植物光合作用速率下降［6-8］。植物在遭受盐胁迫后细胞内渗透调节系统会过量表达，以此来增加细胞膨压，维持细胞较高的水势，增强其保水能力［9-12］，抗氧化酶系统被激活，以此来清除过氧化氢、超氧阴离子等活性氧（reactive oxygen species，ROS），保护细胞膜系统的完整性［13-14］，也有研究表明，植物在遭受盐胁迫后，其代谢调节系统［脯氨酸（free proline，Pro）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量］会不同程度地升高，而抗氧化酶系统［超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）］活性在低盐浓度下呈升高趋势，随着盐浓度的增加逐渐降低，光合色素含量随盐浓度的升高呈先升高后降低的趋势，生物产量降低，如株高生长和根系生长受限［15］，叶片变小，出现坏死斑点等［16-17］。但是不同植物对NaCl 的耐受程度不同，响应机理不同。

三色堇（Viola tricolor）为堇菜科堇菜属多年生草本，其喜在肥沃、排水良好、富含有机质、pH 为5.4～7.4 的中性壤土或黏壤土上生长，在园林绿化中常用作花坛、花池、花镜以及模纹花坛摆放的材料，同时三色堇全株可药用，具有清热解毒、散瘀、止咳的功能［18］。也有研究表明，三色堇花朵富含花青素、黄酮和类胡萝卜素，具有食用价值［19］，美国及有些国家已培育出食花用三色堇。因此，随着三色堇利用价值的不断拓宽，其栽培面积将不断升高，三色堇的抗逆性研究将会越来越多地受到关注。目前在干旱胁迫［20］、盐胁迫［21-22］、高温胁迫［23-25］及重金属胁迫［26］等方面做了相关研究，其中在NaCl 胁迫下的研究，有的集中在渗透调节物质（Pro、SS、SP）方面，有的集中在抗氧化酶系统（SOD、POD、CAT）方面，有的集中在生长表现方面，有的集中在膜脂过氧化（丙二醛malondialdehyde，MDA）方面，目前没有对三色堇在NaCl 胁迫下的生理生化方面进行系统的研究，而植物的耐盐能力不是某一个指标或某一类指标的表现，而是多因子综合作用，调控植物的抗逆能力。因此本研究以食花用三色堇为对象，通过设置不同浓度的NaCl 进行胁迫，探索三色堇对NaCl 胁迫的响应机制以及其能耐受的最高土壤NaCl 含量，为盐碱地三色堇的栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大花三色堇幼苗，种子购于蓝翔园艺。

1.2 试验方法

1.2.1材料培育 2021 年5 月，将泥炭土（丹麦生产）用蒸馏水浸泡48 h 后，倒掉水分，用蒸馏水反复冲洗3～5次，以此清除泥炭土中可溶性离子，之后用50%的可湿性多菌灵粉剂灭菌并密封5 d 后装入营养钵（直径×高度=10 cm×15 cm）待用。用蒸馏水将营养钵中基质浇透后每营养钵播种2 粒种子，等发芽长出2 片真叶后，每营养钵保留1 株幼苗，待幼苗长出5～6 片真叶（苗龄45 d 左右）时进行盐胁迫处理。

1.2.2试验处理 NaCl 设置6 个浓度处理，为0（CK，蒸馏水浇灌）、25、50、100、150、200 mmol·L-1，每浓度处理3 次重复，每重复30 株（钵），每隔2 d 处理一次。在处理时为避免盐冲激效应［27］，对浓度高于25 mmol·L-1的处理，每隔1 d 用高一浓度的处理液进行浇灌，直至到达设定浓度后，每隔1 d 用目标浓度的处理液浇灌1 次，每次灌溉量为基质持水量的2 倍，确保有2/3 的处理溶液流出，以此将前期由于水分蒸发而残留在土壤中的盐分冲洗掉，以保证NaCl 浓度恒定（表1）。在全部处理达到目标浓度时定为盐胁迫处理的第1 天。

表1 NaCl 浓度处理递增表Table 1 Concentration increasing order of NaCl treatments

1.2.3取样及测定 在处理达到预定浓度后的第7 和14 天，每重复随机选择10 株进行生长指标和生理指标测定。每重复选择10 株三色堇植株，每株选择大小一致的3 片叶片，共30 片，装入液氮中，供生理指标测定用，每一指标测定时，用直径为0.5 cm 的打孔器进行每叶片取样，混合叶片作为样品，采用酶标仪（spectra MAX 190，美国）进行测定。

采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量；采用磺基水杨酸提取法测定游离脯氨酸含量；采用考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白含量；采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性，采用分光光度法测定叶绿素（chlorophyll，Chl）含量，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量［28-29］。

在处理第0 天测定茎基部到顶芽处的高度H0（cm），处理第7 和14 天测定茎基部至顶芽处的高度H7、H14（cm）。株高净生长量Δi=Hi-H0，式中：Δi为处理后第i天的株高净生长量，H0为处理第0 天的株高，Hi为处理后第i天的株高，i=7 或14。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 17.0 软件进行方差分析，采用Duncan 法检验各处理之间差异性，采用Microsoft Excel 2010 软件进行作图及隶属函数分析。

如果该指标与抗盐能力呈正相关，计算公式为（1），如该指标与抗盐能力呈负相关，计算公式为（2），式中：i=1，2，3，…，n，Xi为指标测定值，Xmax和Xmin为该指标测定的最大值和最小值。隶属函数平均得分计算公式为（3），UA值高则表明耐盐能力强，反之则低。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫对三色堇株高生长的影响

NaCl 处理三色堇植株后，在处理浓度≤50 mmol·L-1时，对株高净生长量有明显的促进作用，在14 d 时，25 mmol·L-1处理株高净生长量最高，为1.06 cm，在100 mmol·L-1时，14 d 的株高净生长量和CK 相等，为0.66 cm，当浓度＞100 mmol·L-1时对株高净生长造成了抑制，并随浓度的升高抑制作用加剧，在200 mmol·L-1时，株高净生长量比对照降低了45.43%。说明NaCl 浓度＞100 mmol·L-1时对株高生长的抑制作用明显（图1）。

图1 NaCl 处理下三色堇株高净生长量Fig. 1 Net growth of plant height of V. tricolor under NaCl treatments

2.2 NaCl 处理对三色堇光合色素含量的影响

随着NaCl 处理浓度的增加，光合色素含量在处理后第7 和14 天均呈先升高后降低的趋势（图2）。在处理的第14 天，NaCl 胁迫浓度为50 mmol·L-1时Chl含量比CK 增加了6.50%；在浓度为200 mmol·L-1时，比CK 降低了30.05%。随着处理时间的延长，处理浓度≥50 mmol·L-1时，NaCl 处理第14 天的光合色素含量均低于第7 天。说明浓度≤50 mmol·L-1的NaCl 处理能明显提高三色堇植株Chl 含量，大于此浓度，光合色素的降解速度加剧。

图2 NaCl 处理下三色堇植株叶绿素含量Fig.2 Chlorophyll content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.3 NaCl 胁迫对三色堇渗透调节物质的影响

随NaCl 处理浓度的增加，SP 含量在处理的第7和14 天均呈先上升后降低的趋势，在处理的第14 天，在胁迫浓度为50 mmol·L-1时，SP 含量最高，比CK 增加了96.75%；在胁迫浓度为200 mmol·L-1时比CK降低了14.65%（图3）。随着处理时间的延长，各浓度NaCl 处理第14 天SP 含量均低于第7 天，各浓度盐胁迫处理后SP 含量均大于对照（除200 mmol·L-1处理第14 天），并随着处理时间的延长，增加幅度呈降低趋势。说明三色堇植株经NaCl 处理后，能显著提高SP 含量。

随着NaCl 处理浓度的增加，SS 和Pro 含量在处理的第7 天均呈持续升高趋势，在第14 天呈先上升后降低的趋势。SS 含量在处理的第14 天，胁迫浓度为50 mmol·L-1时最高，比CK 增加了427.65%，在浓度为200 mmol·L-1时比CK 增加了228.38%。除200 mmol·L-1处理外，随着处理时间的延长，各浓度处理第14 天时SS 含量均高于第7 天，且均高于CK，并随着处理浓度的升高，增加幅度呈降低趋势（图3）。说明三色堇植株经NaCl 处理后，能显著提高SS 含量。

Pro 含量在处理的第14 天，胁迫浓度为150 mmol·L-1时最高，比CK 增加了121.08%；浓度为200 mmol·L-1时比CK 增加了28.46%。除25 mmol·L-1处理外，随着处理时间的延长，处理第14 天时Pro 含量均低于第7 天（图3）。在处理14 d 时，浓度≥150 mmol·L-1时，Pro 含量高于CK，说明在处理早期（7 d）NaCl 胁迫能明显提高三色堇植株Pro 含量，在处理晚期（14 d），当浓度≥150 mmol·L-1时，能显著提高Pro 含量。

图3 NaCl 处理下三色堇植株可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸含量Fig. 3 Soluble protein，soluble sugar and free proline content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.4 NaCl 处理对三色堇抗氧化酶系统活性的影响

随着NaCl 处理浓度的增加，POD 活性在处理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趋势。在处理的第14 天，胁迫 浓 度 为50 mmol·L-1时，POD 活 性 最 高，比CK 增 加 了89.60%；在 浓 度 为200 mmol·L-1时，比CK 降 低 了8.33%（图4）。随着处理时间的延长，各浓度NaCl 处理第14 天的POD 活性均高于第7 天。浓度≤150 mmol·L-1处理三色堇植株能显著提高POD 活性。

随着NaCl 处理浓度的增加，SOD 活性在处理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趋势。在处理的第14 天，在胁 迫 浓 度 为50 mmol·L-1时，SOD 活性 最 高，比CK 增 加了52.41%；在浓 度 为200 mmol·L-1时，比CK 降 低 了11.91%（图4）。随着处理时间的延长，各浓度NaCl 处理第14 天SOD 活性均低于第7 天。浓度≤150 mmol·L-1NaCl 处理三色堇植株能显著提高SOD 活性。

图4 NaCl 处理下三色堇植株过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性Fig. 4 Peroxidase， superoxide dismutase and catalase activity of V. tricolor leaves under NaCl treatments

随着NaCl 处理浓度的增加，CAT 活性在处理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趋势。在处理的第14 天，NaCl 胁 迫 浓 度 为100 mmol·L-1时，CAT 活 性最高，比CK 增加了319.39%；在浓度为200 mmol·L-1时，比CK 降低了17.97%（图4）。随着处理时间的延 长，≤100 mmol·L-1处 理 的 第14 天 时CAT 活 性 均高于第7 天。浓度≤150 mmol·L-1处理三色堇植株能显著提高CAT 活性。

2.5 NaCl 处理对三色堇MDA 含量的影响

随着NaCl 处理浓度的增加，MDA 含量在处理后第7 和14 天均呈升高的趋势。在处理的第14 天，NaCl 的胁迫浓度为200 mmol·L-1时最高，比CK 增加了101.97%（图5），说明随着NaCl 浓度的升高，膜脂过氧化和细胞膜受损程度加剧。

图5 NaCl 处理下三色堇植株MDA 含量Fig.5 MDA content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.6 NaCl 处理对三色堇植株胁迫的综合评价

植物的耐盐能力不是某一个因子的单独作用，而是与耐盐能力密切相关的众多因子的综合作用，因此为了准确评价NaCl 处理后三色堇耐盐能力和最高耐盐浓度，对所测定参数进行隶属函数分析（表2），结果表明，三色堇植株经≤150 mmol·L-1的NaCl 处理后隶属函数平均得分均高于CK 第0 天（0.318），说明浓度≤150 mmol·L-1的处理可通过提高SS、SP、Pro 含量，激活CAT、POD、SOD 活性，减缓Chl 的降解进程，而NaCl 浓度在200 mmol·L-1时，得分低于CK 第0 天，说明代谢调节物质的积累和抗氧化酶活性受到严重影响，Chl 降解加剧，光合系统遭到严重破坏，严重抑制了三色堇的生长。

表2 NaCl 处理下各指标的隶属函数得分Table 2 Membership function score of V.tricolor under NaCl treatment

NaCl 处理隶属函数综合得分排序为：50 mmol·L-1＞25 mmol·L-1＞100 mmol·L-1＞150 mmol·L-1＞CK＞200 mmol·L-1。从综合排序结果看，三色堇植株对NaCl 的最高耐受浓度为150 mmol·L-1。

3 讨论

NaCl 是土壤中最常见的中性盐，由于在农业生产中长期的灌溉行为，导致土壤中盐分积累。土壤中的盐分一部分是通过灌溉水引入，另一部分是通过土壤水分蒸发，将土壤深层盐分运移到表层［30］，土壤中盐分的增加影响植物的正常生长，严重时会使植物代谢失调，甚至死亡。本研究发现，土壤中存在一定浓度的NaCl 有利于三色堇的生长，但是当土壤中NaCl 浓度过高时，对三色堇生长会起到不良的影响。

植物在逆境胁迫下，通过主动积累SS、SP、Pro 等渗透调节物质来维持细胞渗透势，避免盐分过多地进入细胞，从而降低逆境的危害程度，其累积量与抗逆性呈正相关［31］。本研究发现，三色堇在NaCl 胁迫下，SS、SP、Pro积累量显著高于对照，说明三色堇在NaCl 胁迫下，通过提高细胞内的渗透调节物质的含量来提高细胞的渗透压，进而维持细胞的吸水和保水能力，减缓NaCl 胁迫对细胞的伤害，这与Al-Farsi 等［32］的研究结果一致。

植物在逆境胁迫下，通过提高抗氧化酶的活性来清除过氧化氢、超氧阴离子等ROS［13，33］，以减缓ROS 对细胞的伤害，其活性与植物的抗逆性呈正相关。本研究发现，三色堇植株经NaCl 处理后，抗氧化酶系统SOD、POD、CAT 整体表现出先升高后降低趋势，在处理14 d，在盐浓度≤150 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT 活性高于CK，当处理浓度＞150 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT 活性均低于CK，说明盐浓度＞150 mmol·L-1时，加剧了三色堇细胞膜脂过氧化程度。渗透调节物质含量和抗氧化酶活性，在处理14 d 时均表现出随浓度的升高而降低的趋势，这可能是当NaCl 浓度高于三色堇自身能调节的范围时，导致代谢调节系统和抗氧化酶系统的紊乱，防御系统已不能维持较高水平，进而抑制了三色堇的生长和发育，这与梁晓艳等［3］的研究结果一致。

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，在盐胁迫下，由于金属离子的毒害作用，导致叶绿素降解［34］，其降低程度与植物所受离子胁迫程度呈正相关。本研究发现，在NaCl 胁迫下，50 mmol·L-1处理时Chl 含量最高，当浓度＞50 mmol·L-1时Chl 含量低于CK，说明超过此浓度，盐胁迫引起了Chl 的降解，降低了光合作用速率，这与吕秀云等［35］的研究结果一致。

MDA 是细胞膜脂质过氧化的产物，其含量与植物的抗逆性呈负相关［36］，因此可以用MDA 含量评价植物的抗逆境能力。本研究发现，NaCl 胁迫后，MDA 含量在整个处理期均呈升高趋势，说明随着NaCl 浓度的升高，胁迫程度加剧，对质膜系统的伤害加大，这可能与脂质过氧化而引起的细胞膜受损导致电解质外渗有关。细胞膜是外界盐离子进入植物细胞的第1 道屏障，在植物抗盐生理中有重要作用［37］，当细胞组织受到离子胁迫时，三色堇体内自由基的大量产生引发脂质过氧化［38］，细胞膜的完整性和功能受到伤害，膜的稳定性降低，导致细胞内的原生质体和大分子物质通过损伤部位大量外溢［37-39］，进而影响三色堇的正常代谢，严重时会导致细胞死亡，这与李子英等［36］的研究结果一致。

生长量是植物的生理生化过程反馈于植物的外在表现，也是可以用肉眼直接观测到的表型特征，能对植物在逆境胁迫下的抗逆能力进行直观的观测，植物在逆境环境下的生长量与抗逆能力呈正相关，生长好，则表明其抗逆能力强［36］。本研究发现，在盐浓度≤50 mmol·L-1NaCl 处理下，株高净生长量高于CK，说明低浓度盐胁迫下，能促进三色堇植株的生长，当盐浓度＞50 mmol·L-1时，随着盐浓度的升高，三色堇株高生长量明显下降，说明盐浓度＞50 mmol·L-1时，对三色堇植株的生长造成抑制，这与张丽平等［40］的研究结果一致。

植物的抗逆性是诸多生理生化因子综合作用的结果，本研究采用隶属函数法分析表明，三色堇植株最高耐受NaCl 的浓度为150 mmol·L-1，超过此浓度，其生长受限，可能是随NaCl 浓度的升高，Na+和Cl-浓度同时升高而产生的双重离子胁迫作用。有研究表明，Cl-是植物16 种必需营养元素之一，在植物体内主要以离子形态存在，它参与光合作用的光系统Ⅱ中水的光解放氧反应，还能提高细胞的渗透压和植物组织的水合作用，具有一定的生理功能［4-5］，但是植物对Cl-的需要量较少，当Cl-过多时会造成离子毒害，抑制植物生长，因此低浓度的NaCl 处理，提供了三色堇生长所必需的Cl 元素，但Cl-浓度过高时则成为有害元素，抑制其生长。Na 元素不是植物生长所必需的元素，土壤中Na 元素的存在，会对植物造成离子伤害，且与浓度呈正相关。有研究表明，当土壤中Na+过高时，Na+将取代细胞膜上的Ca2+，导致细胞膜出现漏洞，细胞内原生质体外渗，进而引起离子种类和离子浓度发生改变造成叶绿体破坏，使植物光合速率下降［6］。也有研究表明，三色堇幼苗能耐受250 mmol·L-1以下的NaCl 胁迫，但当浓度高于250 mmol·L-1时，植株出现大量死亡［22］，本研究中也观测到这种现象，在200 mmol·L-1NaCl 处理时，植株出现萎蔫、部分死亡现象。

4 结论

NaCl 处理三色堇植株后，对其抗氧化酶系统、渗透调节系统、光合色素、MDA 以及株高净生长量产生了显著影响。在处理后14 d，随处理浓度升高，SS、SP、Pro、CAT、POD、SOD、Chl 均呈先升高后降低的趋势，MDA 呈升高趋势，株高生长量呈降低趋势。隶属函数分析表明，当土壤中NaCl 浓度≤150 mmol·L-1时对三色堇的生长无明显抑制作用，当浓度＞150 mmol·L-1时，对其生长抑制作用明显。三色堇耐NaCl 的最高浓度为150 mmol·L-1，超过此浓度，代谢调节物质的积累和抗氧化酶系统的活性受到严重影响，Chl 降解加剧，光合系统遭到严重破坏，三色堇的生长受到严重影响。