鼻内翻性乳头状瘤中HPV 感染状况分析

谢佳 颜永毅 龚辉成

作为一种来源于鼻黏膜上皮组织的良性肿瘤，鼻内翻性乳头状瘤（NIP）有鲜明的临床特点，即易侵蚀破坏周围组织、术后易复发、有癌变倾向。据文献报道其发病率为0.03%～0.84%，在鼻腔鼻窦乳头状瘤中约占70%，在全部鼻部肿瘤中占0.5%～4.0%，超过10%的NIP 可能会发生癌变。Holm 等在研究NIP 的发病因素时发现1984 至2014 年NIP 发病率上升了7.6%。绝大多数学者在研究NIP 起病相关因素时发现，HPV 感染与NIP发生、进展有着极大关系。国内外已有不少关于HPV 与NIP 发生发展关系的文献报道，但以往报道的相关研究样本量相对较少，缺乏代表性，且样本中HPV 检出率在0%～86%，检测结果大相径庭，故HPV 与NIP 的关系成为当下临床研究关注的重点。笔者团队将在本次实验中分析HPV 在NIP 中的感染情况，并且运用核酸分子快速导流杂交基因芯片分型技术（HybriMax）检测NIP 中的HPV 亚型，为进一步研究 HPV 介导NIP 发病、复发及恶变机制提供实验及理论依据。

资料与方法

一、临床资料

选取广州市第十二人民医院住院患者的石蜡包埋存档组织标本，2010 至2019 年48 例经病理确诊为NIP （男32 例，女16 例，中位年龄52.2 岁）患者的石蜡包埋组织标本作为NIP 实验组；另取同期20 例因鼻中隔偏曲行鼻中隔矫正患者术中所取鼻中隔切口边缘黏膜组织的石蜡包埋标本（男11 例，女9 例，中位年龄45 岁）作为正常鼻黏膜对照组；所有入组患者均在本院耳鼻咽喉头颈外科住院治疗，在只给予手术治疗尚未给予放射治疗、化学治疗、IFN 治疗、免疫治疗等措施的条件下进行病理组织学检查，并排除其他系统的恶性肿瘤。

二、HE 及免疫组织化学（组化）染色

NIP 实验组48 例石蜡标本及正常鼻黏膜对照组20 例石蜡标本均经过10%中性福尔马林溶液固定、脱水及石蜡包埋。

1.常规病理制片

①切片：将每例石蜡标本作4 μm 厚的连续切片4 张；②展片、贴片：在40～45 ℃的水面上，用镊子将蜡片平铺于水面并充分展平，将蜡片贴于载玻片上，载玻片预先涂上0.05%多聚赖氨酸；③烤片：将蜡片放在烤箱中，温度设置为60 ℃，时间设置为0.5～1 h；④脱蜡：使用二甲苯、不同浓度乙醇进行脱蜡；⑤染色：进行HE 及免疫组化染色，根据试剂盒具体做法进行操作（4 张切片中，2 张切片行目的蛋白免疫组化染色、1 张切片行HE 染色、剩下1 张切片则用于设置空白对照）。

2.判断标准

在400 倍显微镜下，选取5 个视野，需遵循随机取样原则，观察5 个视野中的细胞染色情况。①根据5 个视野中观察到的染色细胞平均百分比记分： 0%～10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、超过76%。分别记为1 分、2 分、3 分、4分、5 分。②根据5 个视野中观察到的细胞着色强度进行分级：未着色、淡黄色、黄色、棕黄色，分别记为0 级、1 级、2 级、3 级。③最终判定：根据①、②结果的乘积判定，＜ 3 为（-），定义为阴 性 表 达；3～6 为（+）、7～9 为（++）、10～12 为（+++），均定义为阳性表达。病理切片的观察、结果读取及记录由2 位医师负责，由符合资质的病理科医师进行最终审核。

三、运用HybriMax 检测HPV 病毒分型检测

1.材料准备

将NIP 实验组中的48 例石蜡标本及正常鼻黏膜对照组中的20 例石蜡标本随机进行排列，从每个标本上连续切下3 片石蜡组织，厚度均为10 μm，并将切下的石蜡组织放入干净研钵。

在研钵中加入适量液氮后充分研磨，根据试剂盒说明进行DNA 的提取。

PCR 总反应体积为25 μL，其中含有PCR premix 23.25 μL、Taq 酶0.75 μL、不同标本的HPV DNA 1 μL，并设置蒸馏水作为HPV 阴性对照，在PCR 仪上设置好反应程序，循环次数为40 次。

将低密度基因芯片放入导流杂交仪中，芯片标记有21 种常见HPV 寡核苷酸探针（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304），根据试剂盒具体做法进行操作，酶标显色。以上全过程需进行无菌操作。

四、统计学处理

采用统计软件SPSS 22.0。计数资料用率或构成比表示，计数资料比较采用检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、HPV 在NIP 实验组与正常鼻黏膜对照组中的感染情况

NIP 实验组与正常鼻黏膜对照组HPV 感染情况见表1。

表1 NIP 实验组与正常鼻黏膜对照组HPV 感染情况（例）

经统计学分析，NIP 实验组与正常鼻黏膜对照组的中位年龄、性别比较差异均无统计学意义（P均＞ 0.05）。NIP 实验组组织标本中HPV 总阳性率为64.58%（31/48），正常鼻黏膜对照组组织标本中HPV 阳性率为0（0/20），NIP 阳性率高于正常鼻黏膜对照组，差异有统计学意义 （= 32.178，P ＜ 0.01）。

二、HPV 亚型在NIP 实验组石蜡标本中的分布情况

在48 例NIP 标本中，31 例检测出HPV，其中检测出49 株HPV 病毒，含括12 个亚型：HPV6占4.08%（2/49）、HPV11 占32.65%（16/49）、HPV16 占12.24%（6/49）、HPV18 占4.08%（2/49）、HPV33 占4.08%（2/49）、HPV39 占2.04%（1/49）、HPV44 占10.20%（5/49）、HPV52 占8.16%（4/49）、HPV53 占2.04%（1/49）、HPV56 占2.04%（1/49）、HPV58 占16.30%（8/49）、HPV68 占2.04%（1/49）。

讨 论

NIP 是一种良性肿瘤， 发生于鼻黏膜上皮组织，鉴于其易侵蚀破坏周围组织、术后易复发、有癌变倾向等的显著特点，多数学者认为其是一种交界性肿瘤，各研究中NIP 有较高的复发率及恶变率，其中复发率高达30%～78%，且恶变率可达5%～21%。NIP 的发病因素尚未完全清楚，虽然NIP 患病人群中以中老年男性患者居多，但并无相关研究明确年龄、性别与NIP 发病的关系。国内外许多研究在NIP 标本中检测出HPV，认为NIP的发病与HPV 感染存在密切关系，但受取样、不同检测方法、不同地区及其他因素影响导致检出率差异性较大。目前，HPV 介导NIP 发生发展的机制尚不清楚，且NIP 恶变机制也未明了，在判断NIP 是否会发生恶变及如何有效地降低其复发率等方面研究也有所欠缺。

HPV 是一种双链闭环DNA 病毒，其致病途径是通过感染人体表皮和黏膜鳞状上皮，研究表明HPV 亚型至今已有200 种，可根据HPV 亚型致病力及致癌力2 个方面进行比较，将HPV 亚型归为两类：低危型（HPV 6、11、40、42 等） 、高危型（HPV 16、18、31、33、35 等）。HPV 自 首 次发现以来一直被认为是手足寻常疣、扁平疣及尖锐湿疣的病因。经后期大量研究发现，当受到某些病毒感染时易引起肿瘤发病，如EB 病毒与鼻咽癌，伯基特（Burkitt）淋巴瘤，肝炎病毒与肝癌，HPV 与宫颈癌等，使得人们越来越关注病毒与肿瘤发病之间的关系，研究表明高危型HPV 检测对宫颈病变的检出有重要意义。HPV 不仅与宫颈癌起病有明确关系，还与10%～15%其他部位肿瘤的发病有关联，如阴道、阴茎、肛门等部位， HPV与乳腺癌、头颈部肿瘤、食管癌、膀胱癌等之间也存在联系。随着病毒分子生物学的研究发展，对HPV 感染致病的研究已不再聚焦于宫颈疾病，HPV 与头颈部肿瘤，特别是与NIP 的关系，也成为一项热门研究。近年来，HPV 感染可引发头颈部肿瘤这一结论得到大多数学者的认可。

在NIP 发病相关因素的研究中，大多数学者认为HPV 感染与NIP 的发生发展密切相关。Syrjantn 等（1987 年）最先运用原位DNA 杂交技术在NIP 中检测出HPV DNA。此后，国内外不断出现有关HPV 感染与NIP 的发生发展关系的研究报道。Beck 等（1995 年）研究了32 例NIP 的病理标本，应用PCR 技术发现有20 个标本被检出HPV 阳性（20/32，62.5%），得出NIP 与HPV 感染有关的结论。McGovern 等报 道HPV 检出率为76.2%（16/21）。包永新等对HPV16 与NIP进行研究，发现NIP 中HPV16 阳性率为62.5%，NIP 伴癌前病变中HPV16 阳性率达66.7%，说明在NIP 致病过程中HPV16 可能起到关键作用。关亚峰等运用PCR 技术在NIP 中检测出HPV57，阳性率为78.3%，得出HPV57 可能与NIP 的发病密切相关。有研究表明NIP 同时合并2 种HPV 亚型感染率达17.5%，合并3 种HPV 亚型感染率达6.7%。赵仁伍等研究使用荟萃分析法证实了HPV 感染可以增加NIP 发病的风险，并可能在NIP 的复发中起到至关重要的作用。王茂华等用荟萃分析法进一步验证了HPV 感染与NIP 的发生、复发及癌变相关。同时，有研究表明NIP 癌变中高危型HPV 感染率明显高于复发及原发NIP，而NIP 复发中高危型HPV 感染率明显高于原发NIP。Hwang 等（1998 年）应用PCR 技术 对42例NIP 石蜡包埋组织进行研究，发现良性NIP 中有HPV6 和HPV11 扩增，恶变NIP 中有HPV16 扩增。有学者认为HPV16、11/16、18、16/18 可以增加NIP 癌变的风险，而HPV6、11、6/11（尤其是HPV6）被认为是NIP 复发的危险因素。有学者研究表明，鳞状上皮增生、角化过度、核分裂像增加是影响NIP 预后及复发的重要指标。然而不少学者研究则表明HPV 感染与NIP 复发无明显关系，故HPV 感染是否促进了NIP 的复发仍然存在争议。

本研究中针对NIP 中HPV 感染及表达情况，笔者团队运用了HE、免疫组化染色及HybriMax，结果显示在所有NIP 石蜡标本中HPV 总阳性率为64.58%，远高于对照组的0。在48 例NIP 标本中，检测出49 株HPV 病毒，含括12 个亚型（HPV6、11、16、18、33、39、44、52、53、56、58、68），认为HPV 感染与NIP 的发生有着密切关系，特别是HPV11、16、44、58 亚型。

综上所述，国内NIP 的发生发展与感染了HPV11、16、44、58 亚型的可能性最大，但HPV如何致癌的分子途径尚未研究明白，有待深入研究。