复发性流产患者淋巴细胞主动免疫的治疗效果及其与HLA抗体的相关性研究

陈晨，文志发，刘佳

（南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004）

0 引言

依据世界卫生组织指南，反复性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的定义为和同一配偶发生连续三次及以上且妊娠小于28周的自然妊娠失败，是一种比较常见的妊娠并发症，引起RSA的病因复杂且无典型的临床表现，其中能找到明确病因的仅占50%，另一部分无明确病因的称为原因不明反复自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）[1]。RSA的病因多样，主要包括母体生殖道解剖异常，内分泌紊乱，夫妻染色体异常，生殖系统感染，宫颈机能不全，免疫功能异常及血栓形成倾向，其中大部分与免疫紊乱有关[2]。而免疫性流产又可以分为自身免疫型和同种免疫型，其中同种免疫型流产的发生则与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）免疫应答密切相关[3]，临床上往往表现为患者血清的HLA抗体检测结果呈阴性。目前，随着医疗水平不断进步，淋巴细胞主动免疫治疗（lymphocyte active immunotherapy, LAI）已经作为专门用于RSA患者中以HLA抗体缺乏为特征的重要临床诊疗措施[4-5]。根据近年临床案例的回顾性分析，淋巴细胞主动免疫治疗可显著提高该类RSA患者最终妊娠的成功率，同时母子的安全性良好[6-7]。本院与南京市红十字血液中心合作，血液供应者以无偿献血的方式一次性献全血400mL，选取全血经成分分离后的白膜用于淋巴细胞的提取，然后用自体血浆深低温冻存，使用时分次复苏后供RSA患者用于免疫治疗。本研究统计分析淋巴细胞主动免疫治疗前后患者体内抗HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ抗体的变化情况及治疗效果，并初步探讨其间的关系。

1 材料和方法

1.1 对象

选择2019年10月至2020年10月由本院中医科门诊确诊的82例RSA患者，连续自然流产≥3次，血常规、肝肾功能及凝血功能均正常，抗心磷脂抗体、抗β2糖蛋白抗体、抗子宫内膜抗体检测结果均为阴性，无传染病性疾病，HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体为阴性，并且排除染色体异常、子宫解剖结构异常、内分泌异常、自身免疫性疾病。

1.2 试剂

HLA特异性抗体检测试剂盒（美国莱姆德公司）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴细胞制备

首先确定丈夫无传染性疾病（乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒），然后献全血400mL，通过成分分离形成白膜，经Ficoll密度梯度离心法获得淋巴细胞，由90%自体血浆+10%二甲基亚砜重悬，调节淋巴细胞浓度至（2-4）×107个/mL，程序降温置于液氮中冻存，复苏方可后使用。

1.3.2 免疫方法

复苏后的淋巴细胞给予患者前臂内侧多点皮下注射。

1.3.3 治疗方案

皮下注射淋巴细胞4次为一个疗程，每次注射间隔时间为2周，一个疗程后复查患者体内的HLA抗体，若结果转为阳性，可考虑备孕，孕后再加强注射3~4次，每次间隔3~4周，直至孕12周。若转阳备孕后未能妊娠，每隔6~8周加强注射1次。若HLA抗体检测结果未转阳，需继续进行一疗程免疫治疗后再考虑妊娠。

1.3.4 HLA抗体检测

研究对象均于早上抽取空腹静脉血3mL，静置30min后以3500转每分钟离心15min，然后分离血清于冻存管，置于-20℃冰箱保存，测定前血清经解冻并平衡至室温。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体，严格按照HLA特异性抗体检测试剂盒（美国莱姆德公司）说明书进行操作。

1.4 数据分析

1.4.1 HLA抗体转阳率比较

患者第一疗程结束7天后抽血，检测其血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体，计算第一疗程HLA抗体的转阳率。第一疗程未转阳患者，继续予以第二疗程然后再次检测，计算第二疗程HLA抗体转阳率和累计转阳率。

1.4.2 妊娠成功率比较

妊娠成功的判断标准为至少需满足妊娠≥14周且B超检查未见异常。随访RSA患者，统计各组妊娠成功率，以其作为疗效评价的依据。

1.5 统计学方法

运用SPSS 23.0软件进行数据统计学分析，计数资料用率表示，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA抗体转阳率统计

82例RSA患者依据上述治疗方案进行免疫治疗，第一疗程结束后有54例HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体转阳，第一疗程的转阳率为65.9%；第二疗程结束后又有19例HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体转阳，累计转阳率为89%。

2.2 淋巴细胞主动免疫治疗后HLA抗体阳性与阴性者再次妊娠成功率统计

82例接受治疗患者中，治疗前82例HLA抗体均为阴性，治疗后73例产生HLA抗体（累计转阳率89%），其中再次妊娠成功66例，成功率90.4%；未产生HLA抗体的9例中，成功1例，成功率11.1%，HLA抗体阳性者再次妊娠成功率显著高于阴性者，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 82例RSA患者淋巴细胞主动免疫治疗后HLA抗体转阳率统计(n,%)

表2 82名RSA患者淋巴细胞主动免疫治疗后HLA抗体阳性与阴性者妊娠成功率统计

3 讨论

RSA的发生在育龄女性中并不罕见，同时其再次流产的风险伴随流产次数的增加而不断升高，据相关文献报道，RSA患者再次流产的概率可高达75%[8]。随着我国生殖免疫学不断进步，不少学者逐步认识到RSA的发生与发展和患者的免疫功能异常息息相关[9]。近年来，也出现由于抗核抗体导致RSA的几种假说：（1）抗核抗体的抗原具有RNA多聚酶的作用，产生的相关抗体引起RNA转录障碍，使得DNA无法复制，从而导致流产的发生。（2）由于外界因素侵犯了自身的免疫屏障，促进淋巴细胞活化，而活化生成的淋巴细胞中的染色质是引起抗核抗体产生的重要抗原，累积的免疫原不断刺激免疫系统，从而导致RSA的发生与发展。（3）抗核抗体可能干扰了胚胎细胞复制分裂的过程，从而引起流产[10]。（4）抗核抗体参与形成的免疫复合物沉着于蜕膜血管组织的表面，影响胎盘的正常发育，因而引发流产[11]。（5）还有少数观点认为抗核抗体可能会阻碍子宫内膜的发育，影响胚胎着床和生长，最终导致流产[12]。

从生殖免疫学角度分析，妊娠可设想为是一种半同种移植的过程，而流产则可视为半同种移植的失败[13]。有研究发现，由于RSA患者人类白细胞抗原（HLA）相容性增强，HLA抗体呈阴性，母体对胚胎父系同种抗原呈低识别或者低反应状态，以致不能够产生足量的保护性抗体，胚胎就会遭受母体免疫系统的攻击反应，最终导致流产[14-15]。

针对RSA患者的淋巴细胞主动免疫疗法，经过几十年的临床验证，帮助大部分RSA患者妊娠成功并分娩，其治疗效果有目共睹。主动免疫治疗是用他人富含人类白细胞抗原的淋巴细胞对患者进行多次皮下注射，有效刺激机体产生HLA抗体，诱导机体对胚胎产生免疫耐受。但同时大量临床案例也表明RSA患者是否能够产生HLA抗体与其接触抗原量、免疫反应次数等因素有关。大量研究表明主动免疫治疗后产生的HLA抗体与再次妊娠的成功率呈正相关，因此主动免疫治疗后对HLA抗体的监测尤为重要[16]。

本研究中82例RSA患者免疫治疗前HLA-Ⅰ、Ⅱ抗体检测结果均为阴性，在接受淋巴细胞主动免疫治疗两个疗程后，73例HLA抗体转阳，HLA抗体转阳后再次妊娠的成功率高达90.4%，而HLA抗体仍为阴性的妊娠成功率仅为11.1%。由此可证明淋巴细胞主动免疫治疗能有效促使RSA患者HLA抗体转阳，并可提高妊娠成功率。然而本次研究也发现妊娠成功者中仍有1例HLA-Ⅰ、Ⅱ抗体均为阴性，妊娠失败者中也有7例HLA抗体已转阳，分析原因，一方面可能是由于免疫反应具有个体差异；另一方面也说明RSA的病因复杂多样，至今尚未完全明了。

据统计，经淋巴细胞主动免疫治疗分娩的婴儿各项指标均正常，成功率可达70%以上[17]，证实淋巴细胞主动免疫疗法的确对RSA患者治疗效果良好，而HLA抗体与复发性自然流产（RSA）治疗效果也密切相关，可作为重要的临床监测指标。随着生殖免疫学领域的发展，RSA的发病机理及淋巴细胞主动免疫的治疗机制将得到进一步的阐明。